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Thermophile sind Mikroorganismen, die bei hohen Temperaturen gedeihen. Ihre Untersuchung kann wertvolle Informationen darüber liefern, wie sich das Leben an extreme Bedingungen anpasst. Allerdings ist es mit herkömmlichen optischen Mikroskopen schwierig, hohe Temperaturbedingungen zu erreichen. Es wurden mehrere hausgemachte Lösungen vorgeschlagen, die auf lokaler elektrischer Widerstandsheizung basieren, eine einfache kommerzielle Lösung gibt es jedoch nicht. In diesem Artikel stellen wir das Konzept der mikroskaligen Lasererwärmung über dem Sichtfeld des Mikroskops vor, um hohe Temperaturen für thermophile Studien bereitzustellen und gleichzeitig die Umgebung des Benutzers mild zu halten. Eine Erwärmung im Mikromaßstab bei mäßiger Laserintensität kann mithilfe eines mit Goldnanopartikeln beschichteten Substrats als biokompatibler und effizienter Lichtabsorber erreicht werden. Mögliche Auswirkungen der Flüssigkeitskonvektion im Mikromaßstab, der Zellretention und der zentrifugalen thermophoretischen Bewegung werden diskutiert. Die Methode wurde bei zwei Arten demonstriert: (i) Geobacillus stearothermophilus, ein aktives thermophiles Bakterium, das sich bei etwa 65 °C vermehrt und von dem wir beobachtet haben, dass es unter Erwärmung im Mikromaßstab keimt, wächst und schwimmt; (ii) Thiobacillus sp., eine optimal hyperthermophile Archaee. bei 80°C. Diese Arbeit ebnet den Weg für eine einfache und sichere Beobachtung thermophiler Mikroorganismen mit modernen und erschwinglichen Mikroskopiegeräten.
Im Laufe der Milliarden von Jahren hat sich das Leben auf der Erde entwickelt, um sich an eine Vielzahl von Umweltbedingungen anzupassen, die aus menschlicher Sicht manchmal als extrem gelten. Insbesondere einige thermophile Mikroorganismen (Bakterien, Archaeen, Pilze), sogenannte Thermophile, gedeihen im Temperaturbereich von 45 °C bis 122 °C1, 2, 3, 4. Thermophile leben in verschiedenen Ökosystemen, wie z. B. hydrothermalen Quellen in der Tiefsee und heißen Quellen oder vulkanische Gebiete. Ihre Forschung hat in den letzten Jahrzehnten aus mindestens zwei Gründen großes Interesse geweckt. Erstens können wir von ihnen beispielsweise lernen, wie Thermophile 5, 6, Enzyme 7, 8 und Membranen 9 bei so hohen Temperaturen stabil sind oder wie Thermophile extremer Strahlung standhalten können10. Zweitens sind sie die Grundlage für viele wichtige biotechnologische Anwendungen1,11,12 wie die Kraftstoffproduktion13,14,15,16, die chemische Synthese (Dihydro, Alkohole, Methan, Aminosäuren usw.)17, Biobergbau18 und thermostabile Biokatalysatoren7,11. 13. Insbesondere bei der derzeit bekannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR)19 handelt es sich um ein Enzym (Taq-Polymerase), das aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, einem der ersten entdeckten Thermophilen, isoliert wurde.
Allerdings ist die Erforschung von Thermophilen keine leichte Aufgabe und kann in keinem biologischen Labor improvisiert werden. Insbesondere lebende Thermophile können mit keinem Standard-Lichtmikroskop in vitro beobachtet werden, selbst mit handelsüblichen Heizkammern, die normalerweise für Temperaturen von nur 40 °C ausgelegt sind. Seit den 1990er Jahren haben sich nur wenige Forschungsgruppen der Einführung von Hochtemperaturmikroskopiesystemen (HTM) gewidmet. 1994 stellten Glukh et al. Die Heiz-/Kühlkammer wurde auf der Grundlage der Verwendung einer Peltier-Zelle konzipiert, die die Temperatur von rechteckigen Kapillaren regelt, die geschlossen sind, um die Anaerobität aufrechtzuerhalten 20 . Das Gerät kann mit einer Geschwindigkeit von 2 °C/s auf bis zu 100 °C erhitzt werden, was den Autoren ermöglicht, die Motilität des hyperthermophilen Bakteriums Thermotoga maritima21 zu untersuchen. Im Jahr 1999 stellten Horn et al. Es wurde ein sehr ähnliches Gerät entwickelt, das immer noch auf der Verwendung beheizter Kapillaren basiert, die für die kommerzielle Mikroskopie zur Untersuchung der Zellteilung/-verbindung geeignet sind. Nach einer langen Zeit relativer Inaktivität wurde die Suche nach wirksamen HTMs im Jahr 2012 wieder aufgenommen, insbesondere im Zusammenhang mit einer Reihe von Arbeiten der Wirth-Gruppe, in denen ein von Horn et al. erfundenes Gerät verwendet wurde. Vor fünfzehn Jahren wurde die Beweglichkeit einer großen Anzahl von Archaeen, darunter auch Hyperthermophilen, bei Temperaturen von bis zu 100 °C mithilfe beheizter Kapillaren untersucht23,24. Sie modifizierten außerdem das ursprüngliche Mikroskop, um eine schnellere Erwärmung zu erreichen (mehrere Minuten statt 35 Minuten, um die eingestellte Temperatur zu erreichen) und einen linearen Temperaturgradienten von mehr als 2 cm über das Medium zu erreichen. Dieses Temperature Gradient Shaping Device (TGFD) wurde verwendet, um die Mobilität vieler Thermophilen innerhalb von Temperaturgradienten in biologisch relevanten Abständen zu untersuchen 24, 25 .
Das Erhitzen geschlossener Kapillaren ist nicht die einzige Möglichkeit, lebende Thermophile zu beobachten. Im Jahr 2012 haben Kuwabara et al. Es wurden selbst hergestellte Einweg-Pyrex-Kammern verwendet, die mit hitzebeständigem Klebstoff (Super X2; Cemedine, Japan) versiegelt waren. Die Proben wurden auf eine im Handel erhältliche transparente Heizplatte (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) gelegt, die auf bis zu 110 °C erhitzt werden konnte, aber ursprünglich nicht für die Biobildgebung gedacht war. Die Autoren beobachteten eine effiziente Teilung anaerober thermophiler Bakterien (Thermosipho globiformans, Verdopplungszeit 24 Minuten) bei 65 °C. Im Jahr 2020 haben Pulshen et al. Das effiziente Erhitzen von handelsüblichem Metallgeschirr (AttofluorTM, Thermofisher) wurde mit zwei selbstgebauten Heizelementen demonstriert: einem Deckel und einem Tisch (von einer PCR-Maschine inspirierte Konfiguration). Diese Verbindung führt zu einer gleichmäßigen Flüssigkeitstemperatur und verhindert Verdunstung und Kondensation am Boden des Deckels. Durch den Einsatz eines O-Rings wird ein Gasaustausch mit der Umgebung vermieden. Dieses HTM, Sulfoskop genannt, wurde verwendet, um Sulfolobus acidocaldarius bei 75 °C abzubilden27.
Eine anerkannte Einschränkung all dieser Systeme war die Beschränkung auf die Verwendung von Luftobjektiven, da jegliches Eintauchen in Öl für solch hohe Temperaturen und für die Bildgebung durch > 1 mm dicke transparente Proben ungeeignet war. Eine anerkannte Einschränkung all dieser Systeme war die Beschränkung auf die Verwendung von Luftobjektiven, da jegliches Eintauchen in Öl für solch hohe Temperaturen und für die Bildgebung durch > 1 mm dicke transparente Proben ungeeignet war. Die meisten dieser Systeme sind für die Verwendung von Objekten zuständig, die eine langjährige Erfahrung erfordern Es ist nicht erforderlich, dass sich die Temperatur ändert und die Anzeige erfolgt, wenn die Auflösung größer als 1 mm ist. Ein erkannter Mangel all dieser Systeme war die Beschränkung auf die Verwendung von Luftobjektiven, da jegliche Ölimmersion für solch hohe Temperaturen und für die Visualisierung durch transparente Proben mit einer Dicke von > 1 mm nicht geeignet war.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像. Eine anerkannte Einschränkung all dieser Systeme ist die Einschränkung der Verwendung eines Luftporenspiegels, da jegliches Eintauchen in Öl für die Abbildung transparenter Proben mit einer Dicke von mehr als 1 mm bei so hohen Temperaturen ungeeignet ist. Obligatorisch ist es nicht erforderlich, dass jedes dieser Systeme eine ordnungsgemäße Verwendung von Objekten ermöglicht, die eine dauerhafte Nutzung im gesamten Unternehmen ermöglichen Dies gilt insbesondere für Temperatur- und Anzeigetemperaturschwankungen von mehr als 1 mm. Ein anerkannter Nachteil all dieser Systeme ist die begrenzte Verwendung von Luftlinsen. Ein Eintauchen in Öl ist für derart hohe Temperaturen und die Visualisierung durch transparente Proben mit einer Dicke von mehr als 1 mm ungeeignet.In jüngerer Zeit wurde diese Einschränkung von Charles-Orzag et al. aufgehoben. 28, der ein Gerät entwickelte, das nicht mehr Wärme um das interessierende System herum liefert, sondern im Inneren des Deckglases selbst, bedeckt mit einer dünnen transparenten Schicht eines Widerstands aus ITO (Indium-Zinn-Oxid). Der Deckel kann auf bis zu 75 °C erhitzt werden, indem elektrischer Strom durch die transparente Schicht geleitet wird. Allerdings muss der Autor das Objektiv auch bis zum Objektiv erwärmen, jedoch nicht über 65 °C, um es nicht zu beschädigen.
Diese Arbeiten zeigen, dass die Entwicklung einer effizienten Hochtemperatur-Lichtmikroskopie nicht weit verbreitet ist, häufig selbstgebaute Ausrüstung erfordert und häufig auf Kosten der räumlichen Auflösung erfolgt, was angesichts der Tatsache, dass thermophile Mikroorganismen nicht größer als ein paar wenige sind, einen gravierenden Nachteil darstellt Mikrometer. Ein reduziertes Heizvolumen ist der Schlüssel zur Lösung von drei inhärenten Problemen von HTM: schlechte räumliche Auflösung, hohe thermische Trägheit beim Aufheizen des Systems und schädliche Erwärmung umgebender Elemente (Immersionsöl, Objektivlinse … oder Hände des Benutzers) bei extremen Temperaturen. ).
In diesem Artikel stellen wir ein HTM für die thermophile Beobachtung vor, das nicht auf Widerstandserwärmung basiert. Stattdessen erreichten wir eine lokale Erwärmung innerhalb eines begrenzten Bereichs des Sichtfelds des Mikroskops durch Laserbestrahlung eines lichtabsorbierenden Substrats. Die Temperaturverteilung wurde mittels quantitativer Phasenmikroskopie (QPM) visualisiert. Die Wirksamkeit dieser Methode wird durch Geobacillus stearothermophilus, ein bewegliches thermophiles Bakterium, das sich bei etwa 65 °C vermehrt und eine kurze Verdopplungszeit (ca. 20 Minuten) aufweist, und Sulfolobus shibatae, ein hyperthermophiles Bakterium, das bei 80 °C optimal wächst (Archaeen), demonstriert. zu veranschaulichen. Als Funktion der Temperatur wurden eine normale Replikationsrate und ein normales Schwimmen beobachtet. Dieses Laser-HTM (LA-HTM) ist nicht durch die Dicke des Deckglases oder durch die Art des Objektivs (Luft- oder Ölimmersion) begrenzt. Dadurch kann jedes auf dem Markt erhältliche hochauflösende Objektiv verwendet werden. Es leidet auch nicht unter einer langsamen Erwärmung aufgrund der thermischen Trägheit (erreicht eine sofortige Erwärmung im Millisekundenbereich) und verwendet nur im Handel erhältliche Komponenten. Die einzigen neuen Sicherheitsbedenken beziehen sich auf das Vorhandensein starker Laserstrahlen (normalerweise bis zu 100 mW) im Inneren des Geräts und möglicherweise durch die Augen, für die eine Schutzbrille erforderlich ist.
Das Prinzip von LA-HTM besteht darin, die Probe mithilfe eines Lasers lokal im Sichtfeld des Mikroskops zu erhitzen (Abb. 1a). Dazu muss die Probe lichtabsorbierend sein. Um eine angemessene Laserleistung (weniger als 100 mW) zu verwenden, verließen wir uns nicht auf die Lichtabsorption durch das flüssige Medium, sondern erhöhten die Absorption der Probe künstlich, indem wir das Substrat mit Goldnanopartikeln beschichteten (Abb. 1c). Das Erhitzen von Goldnanopartikeln mit Licht ist für das Gebiet der thermischen Plasmonik von grundlegender Bedeutung und wird voraussichtlich in der Biomedizin, der Nanochemie oder der Sonnenlichtgewinnung Anwendung finden29,30,31. In den letzten Jahren haben wir dieses LA-HTM in mehreren Studien zu thermischen Plasmaanwendungen in der Physik, Chemie und Biologie verwendet. Die Hauptschwierigkeit bei dieser Methode besteht in der Darstellung des endgültigen Temperaturprofils, da die erhöhte Temperatur auf einen Mikrobereich innerhalb der Probe beschränkt ist. Wir haben gezeigt, dass eine Temperaturkartierung mit dem Vierwellenlängen-Transversal-Scherinterferometer erreicht werden kann, einer einfachen, hochauflösenden und sehr empfindlichen Methode der quantitativen Phasenmikroskopie, die auf der Verwendung zweidimensionaler Beugungsgitter (auch Kreuzgitter genannt) basiert. 33,34,35,36. Die Zuverlässigkeit dieser thermischen Mikroskopietechnik, die auf der Wellenfrontmikroskopie mit gekreuzten Gittern (CGM) basiert, wurde in einem Dutzend im letzten Jahrzehnt veröffentlichter Arbeiten nachgewiesen37,38,39,40,41,42,43.
Schema der Installation eines parallelen Lasererwärmungs-, Formungs- und Temperaturmikroskops. b Probengeometrie bestehend aus einer AttofluorTM-Kammer, die ein mit Goldnanopartikeln beschichtetes Deckglas enthält. c Schauen Sie sich die Probe genau an (nicht maßstabsgetreu). d repräsentiert das gleichmäßige Laserstrahlprofil und (e) die simulierte nachfolgende Temperaturverteilung auf der Probenebene der Goldnanopartikel. f ist ein ringförmiges Laserstrahlprofil, das zur Erzeugung einer gleichmäßigen Temperatur geeignet ist, wie in der Simulation der resultierenden Temperaturverteilung in (g) gezeigt. Maßstabsleiste: 30 µm.
Insbesondere ist es uns kürzlich gelungen, Säugetierzellen mit LA-HTM und CGM zu erhitzen und zelluläre Hitzeschockreaktionen im Bereich von 37–42 °C zu verfolgen, was die Anwendbarkeit dieser Technik auf die Bildgebung einzelner lebender Zellen demonstriert. Allerdings ist die Anwendung von LA-HTM auf die Untersuchung von Mikroorganismen bei hohen Temperaturen nicht eindeutig, da sie im Vergleich zu Säugetierzellen mehr Vorsicht erfordert: Erstens führt die Erwärmung des Bodens des Mediums um mehrere zehn Grad (statt nur ein paar Grad) dazu zu einem starken vertikalen Temperaturgradienten. kann eine Flüssigkeitskonvektion 44 erzeugen, die, wenn sie nicht fest mit dem Substrat verbunden ist, eine unerwünschte Bewegung und Vermischung von Bakterien verursachen kann. Diese Konvektion kann durch eine Verringerung der Dicke der Flüssigkeitsschicht beseitigt werden. Zu diesem Zweck wurden in allen unten vorgestellten Experimenten Bakteriensuspensionen zwischen zwei etwa 15 µm dicken Deckgläsern in einem Metallbecher platziert (AttofluorTM, Thermofisher, Abb. 1b, c). Grundsätzlich lässt sich Konvektion vermeiden, wenn die Dicke der Flüssigkeit kleiner ist als die Strahlgröße des Heizlasers. Zweitens kann das Arbeiten in einer derart begrenzten Geometrie zur Erstickung aerober Organismen führen (siehe Abb. S2). Dieses Problem kann vermieden werden, indem ein Substrat verwendet wird, das für Sauerstoff (oder ein anderes lebenswichtiges Gas) durchlässig ist, indem im Deckglas eingeschlossene Luftblasen belassen werden oder indem Löcher in das obere Deckglas gebohrt werden (siehe Abb. S1) 45 . In dieser Studie haben wir uns für die letztere Lösung entschieden (Abbildungen 1b und S1). Schließlich sorgt die Lasererwärmung nicht für eine gleichmäßige Temperaturverteilung. Selbst bei gleicher Intensität des Laserstrahls (Abb. 1d) ist die Temperaturverteilung nicht gleichmäßig, sondern ähnelt aufgrund der thermischen Diffusion eher der Gaußschen Verteilung (Abb. 1e). Wenn das Ziel darin besteht, für die Untersuchung biologischer Systeme präzise Temperaturen im Sichtfeld festzulegen, sind ungleichmäßige Profile nicht ideal und können auch zur thermophoretischen Bewegung von Bakterien führen, wenn diese nicht am Substrat haften (siehe Abb. S3, S4)39. Zu diesem Zweck haben wir einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) verwendet, um den Infrarotlaserstrahl entsprechend der Form des Rings (Abb. 1f) in der Probenebene zu formen, um eine vollkommen gleichmäßige Temperaturverteilung innerhalb eines bestimmten geometrischen Bereichs zu erreichen. trotz thermischer Diffusion (Abb. 1d) 39, 42, 46. Legen Sie ein oberes Deckglas über eine Metallschale (Abbildung 1b), um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden, und beobachten Sie es mindestens einige Tage lang. Da dieses obere Deckglas nicht versiegelt ist, kann bei Bedarf jederzeit problemlos weiteres Medium hinzugefügt werden.
Um die Funktionsweise von LA-HTM zu veranschaulichen und seine Anwendbarkeit in der thermophilen Forschung zu demonstrieren, haben wir die aeroben Bakterien Geobacillus stearothermophilus untersucht, deren optimale Wachstumstemperatur bei etwa 60–65 °C liegt. Das Bakterium verfügt außerdem über Flagellen und die Fähigkeit zu schwimmen, was ein weiterer Indikator für die normale Zellaktivität ist.
Die Proben (Abb. 1b) wurden eine Stunde lang bei 60 °C vorinkubiert und dann in einen LA-HTM-Probenhalter gegeben. Diese Vorinkubation ist optional, aber dennoch nützlich, und zwar aus zwei Gründen: Erstens bewirkt das Einschalten des Lasers, dass die Zellen sofort wachsen und sich teilen (siehe Film M1 in den Zusatzmaterialien). Ohne Vorinkubation verzögert sich das Bakterienwachstum typischerweise jedes Mal um etwa 40 Minuten, wenn ein neuer Betrachtungsbereich auf der Probe erhitzt wird. Zweitens förderte die einstündige Vorinkubation die Adhäsion der Bakterien am Deckglas und verhinderte, dass Zellen aufgrund der Thermophorese beim Einschalten des Lasers aus dem Sichtfeld drifteten (siehe Film M2 in den Zusatzmaterialien). Thermophorese ist die Bewegung von Partikeln oder Molekülen entlang eines Temperaturgradienten, normalerweise von heiß nach kalt, und Bakterien bilden da keine Ausnahme43,47. Dieser unerwünschte Effekt wird über einen bestimmten Bereich eliminiert, indem SLM verwendet wird, um den Laserstrahl zu formen und eine flache Temperaturverteilung zu erreichen.
Auf Abb. Abbildung 2 zeigt die mit CGM gemessene Temperaturverteilung, die durch Bestrahlen eines mit Goldnanopartikeln beschichteten Glassubstrats mit einem ringförmigen Laserstrahl erhalten wurde (Abb. 1f). Über die gesamte vom Laserstrahl abgedeckte Fläche konnte eine flache Temperaturverteilung beobachtet werden. Diese Zone wurde auf 65 °C eingestellt, die optimale Wachstumstemperatur. Außerhalb dieses Bereichs fällt die Temperaturkurve natürlich auf \(1/r\) ab (wobei \(r\) die Radialkoordinate ist).
eine Temperaturkarte von CGM-Messungen, die durch die Bestrahlung einer Schicht aus Goldnanopartikeln mit einem ringförmigen Laserstrahl erhalten wurden, um ein flaches Temperaturprofil über eine kreisförmige Fläche zu erhalten. b Isotherme der Temperaturkarte (a). Die Kontur des Laserstrahls wird durch einen grau gepunkteten Kreis dargestellt. Das Experiment wurde zweimal wiederholt (siehe ergänzende Materialien, Abbildung S4).
Die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen wurde mehrere Stunden lang mit LA-HTM überwacht. Auf Abb. 3 zeigt das Zeitintervall für vier Bilder, die aus einem 3 Stunden 20 Minuten langen Film (Film M3, Zusatzinformationen) aufgenommen wurden. Es wurde beobachtet, dass sich Bakterien innerhalb des vom Laser definierten kreisförmigen Bereichs, in dem die Temperatur optimal war und sich 65 °C näherte, aktiv vermehrten. Im Gegensatz dazu wurde das Zellwachstum deutlich reduziert, wenn die Temperatur 10 s lang unter 50 °C fiel.
Optische Tiefenbilder von G. stearothermophilus-Bakterien, die nach Lasererwärmung zu verschiedenen Zeiten wachsen, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, aus 200 Auszug aus einem einminütigen Film (M3-Film in den Zusatzinformationen), überlagert mit der entsprechenden Temperaturkarte. Der Laser schaltet sich zum Zeitpunkt \(t=0\) ein. Dem Intensitätsbild wurden Isothermen hinzugefügt.
Um das Zellwachstum und seine Temperaturabhängigkeit weiter zu quantifizieren, haben wir die Zunahme der Biomasse verschiedener Kolonien ursprünglich isolierter Bakterien im Sichtfeld von Movie M3 gemessen (Abb. 4). Die zu Beginn der Bildung der Mini Colony Forming Unit (mCFU) ausgewählten Elternbakterien sind in Abbildung S6 dargestellt. Trockenmassemessungen wurden mit einer CGM 48-Kamera durchgeführt, die zur Kartierung der Temperaturverteilung verwendet wurde. Die Fähigkeit des CGM, Trockengewicht und Temperatur zu messen, ist die Stärke des LA-HTM. Wie erwartet führte die hohe Temperatur zu einem schnelleren Bakterienwachstum (Abb. 4a). Wie im halblogarithmischen Diagramm in Abb. 4b gezeigt, folgt das Wachstum bei allen Temperaturen einem exponentiellen Wachstum, wobei die Daten die Exponentialfunktion \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ verwenden {{ \mbox{cst}}}\), wobei \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – Generationszeit (oder Verdopplungszeit), \( g =1/ \tau\) – Wachstumsrate (Anzahl der Teilungen pro Zeiteinheit). Auf Abb. 4c zeigt die jeweilige Wachstumsrate und Generationszeit in Abhängigkeit von der Temperatur. Schnell wachsende mCFUs zeichnen sich durch eine Wachstumssättigung nach zwei Stunden aus, ein erwartetes Verhalten aufgrund der hohen Bakteriendichte (ähnlich der stationären Phase in klassischen Flüssigkulturen). Die allgemeine Form \(g\left(T\right)\) (Abb. 4c) entspricht der erwarteten Zweiphasenkurve für G. stearothermophilus mit einer optimalen Wachstumsrate um 60–65 °C. Passen Sie die Daten mithilfe eines Kardinalmodells an (Abbildung S5)49 wobei \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, was gut mit anderen in der Literatur zitierten Werten übereinstimmt49. Obwohl die temperaturabhängigen Parameter reproduzierbar sind, kann die maximale Wachstumsrate von \({G}_{0}\) von Experiment zu Experiment variieren (siehe Abbildungen S7-S9 und Film M4). Im Gegensatz zu Temperaturanpassungsparametern, die universell sein sollten, hängt die maximale Wachstumsrate von den Eigenschaften des Mediums (Nährstoffverfügbarkeit, Sauerstoffkonzentration) innerhalb der beobachteten Mikroskalengeometrie ab.
a Mikrobielles Wachstum bei verschiedenen Temperaturen. mCFU: Miniaturkoloniebildende Einheiten. Daten aus einem Video eines einzelnen Bakteriums, das in einem Temperaturgradienten wächst (Film M3). b Wie (a), halblogarithmische Skala. c Wachstumsrate\(\tau\) und Generationszeit\(g\), berechnet aus linearer Regression (b). Horizontale Fehlerbalken: Temperaturbereich, über den sich mCFUs während des Wachstums in das Sichtfeld ausdehnten. Vertikale Fehlerbalken: Standardfehler der linearen Regression.
Zusätzlich zum normalen Wachstum schwebten einige Bakterien manchmal während der Lasererwärmung ins Sichtfeld, was bei Bakterien mit Flagellen ein zu erwartendes Verhalten ist. Der Film M5 in der Zusatzinformation zeigt solche Schwimmaktivitäten. In diesem Experiment wurde eine gleichmäßige Laserstrahlung verwendet, um einen Temperaturgradienten zu erzeugen, wie in den Abbildungen 1d, e und S3 dargestellt. Abbildung 5 zeigt zwei aus dem M5-Film ausgewählte Bildsequenzen, die zeigen, dass ein Bakterium eine gerichtete Bewegung zeigt, während alle anderen Bakterien bewegungslos bleiben.
Die beiden Zeitrahmen (a) und (b) zeigen das Schwimmen zweier verschiedener Bakterien, markiert mit gepunkteten Kreisen. Die Bilder wurden aus dem M5-Film extrahiert (als Zusatzmaterial bereitgestellt).
Im Fall von G. stearothermophilus begann die aktive Bewegung der Bakterien (Abb. 5) wenige Sekunden nach dem Einschalten des Laserstrahls. Diese Beobachtung unterstreicht die zeitliche Reaktion dieses thermophilen Mikroorganismus auf einen Temperaturanstieg, wie sie bereits von Mora et al. beobachtet wurde. 24 . Das Thema bakterielle Motilität und sogar Thermotaxis können mit LA-HTM weiter untersucht werden.
Mikrobielles Schwimmen sollte nicht mit anderen Arten physikalischer Bewegung verwechselt werden, nämlich (i) der Brownschen Bewegung, die eine chaotische Bewegung ohne eindeutige Richtung zu sein scheint, (ii) Konvektion 50 und Thermophorese 43, die aus einer regelmäßigen Bewegungsdrift entlang einer Temperatur besteht Gradient.
G. stearothermophilus ist für seine Fähigkeit bekannt, hochresistente Sporen (Sporenbildung) zu produzieren, wenn er als Abwehr widrigen Umweltbedingungen ausgesetzt wird. Wenn die Umweltbedingungen wieder günstiger werden, keimen die Sporen, bilden lebende Zellen und nehmen ihr Wachstum wieder auf. Obwohl dieser Sporulations-/Keimungsprozess gut bekannt ist, wurde er nie in Echtzeit beobachtet. Mithilfe von LA-HTM berichten wir hier über die erste Beobachtung von Keimungsereignissen bei G. stearothermophilus.
Auf Abb. 6a zeigt Zeitrafferbilder der optischen Tiefe (OT), die mit einem CGM-Satz von 13 Sporen erhalten wurden. Während der gesamten Sammelzeit (15 h 6 min, \(t=0\) – Beginn der Lasererwärmung) keimten 4 von 13 Sporen, zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' und \(11\) h \(30\)'. Obwohl in Abbildung 6 nur eines dieser Ereignisse dargestellt ist, sind im M6-Film im Zusatzmaterial 4 Keimungsereignisse zu beobachten. Interessanterweise scheint die Keimung zufällig zu erfolgen: Trotz gleicher Veränderungen der Umweltbedingungen keimen nicht alle Sporen und nicht gleichzeitig.
a Zeitraffer bestehend aus 8 OT-Bildern (Ölimmersion, 60x, 1,25 NA-Objektiv) und (b) Biomasseentwicklung von G. stearothermophilus-Aggregaten. c (b) Auf halblogarithmischer Skala gezeichnet, um die Linearität der Wachstumsrate hervorzuheben (gestrichelte Linie).
Auf Abb. 6b,c zeigt die Biomasse der Zellpopulationen im Sichtfeld als Funktion der Zeit über den gesamten Zeitraum der Datenerfassung. Der bei \(t=5\)h in Abb. beobachtete schnelle Zerfall der Trockenmasse. 6b, c, aufgrund des Austritts einiger Zellen aus dem Sichtfeld. Die Wachstumsrate dieser vier Ereignisse beträgt \(0,77\pm 0,1\) h-1. Dieser Wert ist höher als die Wachstumsrate in Abbildung 3.3 und 4, in der die Zellen normal wachsen. Der Grund für die erhöhte Wachstumsrate von G. stearothermophilus aus Sporen ist unklar, aber diese Messungen unterstreichen das Interesse von LA-HTM und arbeiten auf der Ebene einzelner Zellen (oder auf der Ebene einzelner mCFU), um mehr über die Dynamik des Zelllebens zu erfahren .
Um die Vielseitigkeit von LA-HTM und seine Leistung bei hohen Temperaturen weiter zu demonstrieren, untersuchten wir das Wachstum von Sulfolobus shibatae, einem hyperthermophilen azidophilen Archaeen mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 80 °C51. Im Vergleich zu G. stearothermophilus haben diese Archaeen auch eine ganz andere Morphologie und ähneln eher 1-Mikrometer-Kugeln (Kokken) als länglichen Stäbchen (Bazillen).
Abbildung 7a besteht aus aufeinanderfolgenden optischen Tiefenbildern von S. shibatae mCFU, die mit CGM erhalten wurden (siehe M7-Spielfilm in den Zusatzmaterialien). Diese mCFU wachsen bei etwa 73 °C, unterhalb der optimalen Temperatur von 80 °C, aber innerhalb des Temperaturbereichs für aktives Wachstum. Wir beobachteten mehrere Spaltungsereignisse, die mCFUs nach einigen Stunden wie Mikrotrauben von Archaeen aussehen ließen. Anhand dieser OT-Bilder wurde die mCFU-Biomasse im Zeitverlauf gemessen und in Abbildung 7b dargestellt. Interessanterweise zeigten die mCFUs von S. shibatae ein lineares Wachstum und nicht das exponentielle Wachstum, das bei den mCFUs von G. stearothermophilus beobachtet wurde. Es gibt seit langem eine Diskussion 52 über die Natur der Zellwachstumsraten: Während einige Studien Wachstumsraten von Mikroben berichten, die proportional zu ihrer Größe sind (exponentielles Wachstum), zeigen andere eine konstante Rate (lineares oder bilineares Wachstum). Wie von Tzur et al.53 erläutert, erfordert die Unterscheidung zwischen exponentiellem und (bi)linearem Wachstum eine Präzision von <6 % bei Biomassemessungen, was für die meisten QPM-Techniken unerreichbar ist, selbst wenn sie Interferometrie umfassen. Wie von Tzur et al.53 erläutert, erfordert die Unterscheidung zwischen exponentiellem und (bi)linearem Wachstum eine Präzision von <6 % bei Biomassemessungen, was für die meisten QPM-Techniken unerreichbar ist, selbst wenn sie Interferometrie umfassen. Nach Angaben von Цур и др.53 liegt der Wert des umweltfreundlichen und (bi)linischen Rosts bei maximal 6 % der Biomasse, was für Bolschinisten nicht erforderlich ist Mit QPM-Methoden können Interferometer verwendet werden. Wie von Zur et al.53 erläutert, erfordert die Unterscheidung zwischen exponentiellem und (bi)linearem Wachstum eine Genauigkeit von <6 % bei Biomassemessungen, was für die meisten QPM-Methoden selbst unter Verwendung von Interferometrie unerreichbar ist.Wie von Zur et al. 53 erfordert die Unterscheidung zwischen exponentiellem und (bi)linearem Wachstum eine Genauigkeit von weniger als 6 % bei Biomassemessungen, was für die meisten QPM-Methoden unerreichbar ist, selbst wenn Interferometrie verwendet wird. CGM erreicht diese Genauigkeit mit einer Genauigkeit im Sub-pg-Bereich bei Biomassemessungen36,48.
a Zeitraffer bestehend aus 6 OT-Bildern (Ölimmersion, 60x, NA-Objektiv 1,25) und (b) Entwicklung der Mikro-CFU-Biomasse, gemessen mit CGM. Weitere Informationen finden Sie im Film M7.
Das vollkommen lineare Wachstum von S. shibatae war unerwartet und wurde noch nicht berichtet. Es wird jedoch ein exponentielles Wachstum erwartet, zumindest weil im Laufe der Zeit mehrere Teilungen von 2, 4, 8, 16 … Zellen stattfinden müssen. Wir stellten die Hypothese auf, dass das lineare Wachstum auf eine Zellhemmung aufgrund einer dichten Zellpackung zurückzuführen sein könnte, ebenso wie sich das Zellwachstum verlangsamt und schließlich einen Ruhezustand erreicht, wenn die Zelldichte zu hoch ist.
Abschließend besprechen wir nacheinander die folgenden fünf interessanten Punkte: Reduzierung des Heizvolumens, Reduzierung der thermischen Trägheit, Interesse an Goldnanopartikeln, Interesse an quantitativer Phasenmikroskopie und ein möglicher Temperaturbereich, in dem LA-HTM eingesetzt werden kann.
Im Vergleich zur Widerstandserwärmung bietet die für die HTM-Entwicklung eingesetzte Lasererwärmung mehrere Vorteile, die wir in dieser Studie veranschaulichen. Insbesondere in flüssigen Medien im Sichtfeld des Mikroskops wird das Heizvolumen innerhalb weniger (10 μm) 3 Volumina gehalten. Auf diese Weise sind nur die beobachteten Mikroben aktiv, während andere Bakterien ruhen und zur weiteren Untersuchung der Probe verwendet werden können – es ist nicht erforderlich, die Probe jedes Mal zu wechseln, wenn eine neue Temperatur überprüft werden muss. Darüber hinaus ermöglicht die Erwärmung im Mikromaßstab die direkte Untersuchung eines großen Temperaturbereichs: Abbildung 4c wurde aus einem dreistündigen Film (Film M3) gewonnen, der normalerweise die Vorbereitung und Untersuchung mehrerer Proben erfordert – eine für jede der untersuchten Proben. y ist die Temperatur, die die Anzahl der Tage im Experiment darstellt. Durch die Reduzierung des erhitzten Volumens bleiben auch alle umgebenden optischen Komponenten des Mikroskops, insbesondere die Objektivlinse, auf Raumtemperatur, was bisher ein großes Problem für die Community darstellte. LA-HTM kann mit jedem Objektiv, einschließlich Ölimmersionsobjektiven, verwendet werden und bleibt auch bei extremen Temperaturen im Sichtfeld bei Raumtemperatur. Die Haupteinschränkung der Lasererwärmungsmethode, über die wir in dieser Studie berichten, besteht darin, dass Zellen, die nicht anhaften oder schweben, möglicherweise weit vom Sichtfeld entfernt und schwer zu untersuchen sind. Eine Lösung könnte darin bestehen, Linsen mit geringer Vergrößerung zu verwenden, um einen größeren Temperaturanstieg von mehr als einigen hundert Mikrometern zu erzielen. Diese Vorsicht geht mit einer Verringerung der räumlichen Auflösung einher. Wenn jedoch die Bewegung von Mikroorganismen untersucht werden soll, ist eine hohe räumliche Auflösung nicht erforderlich.
Die Zeitskala für das Aufheizen (und Abkühlen) des Systems \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) hängt von seiner Größe ab. nach dem Gesetz \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), wobei \ (L\) ist die charakteristische Größe der Wärmequelle (der Durchmesser des Laserstrahls in unserer Studie beträgt \(L\ etwa 100\) μm), \(D\) ist die thermische Diffusionsfähigkeit der Umgebung (Durchschnitt in unserer Studie). Fall, Glas und Wasser Diffusionsrate\(D\ etwa 2\fach {10}^{-7}\) m2/s). Daher sind in dieser Studie Zeitreaktionen in der Größenordnung von 50 ms, also quasi augenblicklich Temperaturänderungen sind zu erwarten. Dieser sofortige Temperaturanstieg verkürzt nicht nur die Dauer des Experiments, sondern ermöglicht auch eine genaue Zeiteinteilung \(t=0\) für jede dynamische Untersuchung von Temperatureffekten.
Unsere vorgeschlagene Methode ist auf jedes lichtabsorbierende Substrat anwendbar (z. B. kommerzielle Proben mit ITO-Beschichtung). Allerdings sind Goldnanopartikel in der Lage, eine hohe Absorption im Infrarotbereich und eine geringe Absorption im sichtbaren Bereich bereitzustellen, wobei letztere Eigenschaften für eine effektive optische Beobachtung im sichtbaren Bereich, insbesondere bei Verwendung von Fluoreszenz, von Interesse sind. Darüber hinaus ist Gold biokompatibel, chemisch inert, die optische Dichte kann von 530 nm bis in den nahen Infrarotbereich angepasst werden und die Probenvorbereitung ist einfach und wirtschaftlich29.
Die transversale Gitterwellenfrontmikroskopie (CGM) ermöglicht nicht nur die Temperaturkartierung im Mikromaßstab, sondern auch die Überwachung der Biomasse, was sie in Kombination mit LA-HTM besonders nützlich (wenn nicht notwendig) macht. Im letzten Jahrzehnt wurden andere Techniken der Temperaturmikroskopie entwickelt, insbesondere im Bereich der Biobildgebung, und die meisten von ihnen erfordern den Einsatz temperaturempfindlicher Fluoreszenzsonden54,55. Diese Methoden wurden jedoch kritisiert und in einigen Berichten wurden unrealistische Temperaturänderungen innerhalb von Zellen gemessen, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass die Fluoreszenz von vielen anderen Faktoren als der Temperatur abhängt. Darüber hinaus sind die meisten Fluoreszenzsonden bei hohen Temperaturen instabil. Daher stellen QPM und insbesondere CGM eine ideale Temperaturmikroskopietechnik dar, um Leben bei hohen Temperaturen mithilfe der optischen Mikroskopie zu untersuchen.
Studien an S. shibatae, die bei 80 °C optimal leben, zeigen, dass LA-HTM zur Untersuchung von Hyperthermophilen und nicht nur von einfachen Thermophilen eingesetzt werden kann. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für den Temperaturbereich, der mit LA-HTM erreicht werden kann, und sogar Temperaturen über 100 °C können bei atmosphärischem Druck ohne Sieden erreicht werden, wie unsere 38-köpfige Gruppe bei Anwendungen der hydrothermischen Chemie bei atmosphärischem Druck demonstriert hat Druck A. Ein Laser wird auf die gleiche Weise zum Erhitzen von Goldnanopartikeln 40 verwendet. Somit hat LA-HTM das Potenzial, zur Beobachtung beispielloser Hyperthermophiler mit standardmäßiger hochauflösender optischer Mikroskopie unter Standardbedingungen (dh unter Umweltstress) eingesetzt zu werden.
Alle Experimente wurden mit einem selbstgebauten Mikroskop durchgeführt, einschließlich Köhler-Beleuchtung (mit LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), Probenhalter mit manueller xy-Bewegung, Objektiven (Olympus, 60x, 0,7 NA, Luft, LUCPlanFLN60X oder 60x, 1,25 NA, Öl). , UPLFLN60XOI), CGM-Kamera (QLSI-Kreuzgitter, 39 µm Abstand, 0,87 mm vom Andor Zyla-Kamerasensor) zur Bereitstellung von Intensitäts- und Wellenfrontbildgebung und sCMOS-Kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-Bit-Modus, von Hamamatsu) zur Aufzeichnung der Die in Abbildung 5 dargestellten Daten (Bakterienschwimmen). Der dichroitische Strahlteiler ist ein 749-nm-BrightLine-Kantenteiler (Semrock, FF749-SDi01). Der Filter an der Vorderseite der Kamera ist ein 694-Kurzpassfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan-Saphir-Laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, gepumpter Tsunami-Laserhohlraum, Spectra-Physics in Abb. 2-5, weiter ersetzt durch Millenia-Laser, Spectraphysics 10 W, gepumpter Mira-Laserhohlraum, Coherent, für Abb. 2 -5). 6 und 7) sind auf die Wellenlänge \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm eingestellt, was dem Plasmonenresonanzspektrum von Goldnanopartikeln entspricht. Räumliche Lichtmodulatoren (1920 × 1152 Pixel) wurden von Meadowlark Optics erworben. Die Hologramme wurden mit dem Gerchberg-Saxton-Algorithmus berechnet, wie im Link 39 beschrieben.
Die Kreuzgitter-Wellenfrontmikroskopie (CGM) ist eine optische Mikroskopietechnik, die auf der Kombination eines zweidimensionalen Beugungsgitters (auch Kreuzgitter genannt) in einem Abstand von einem Millimeter vom Sensor einer herkömmlichen Kamera basiert. Das häufigste Beispiel für ein CGM, das wir in dieser Studie verwendet haben, ist ein Vierwellenlängen-Transversalverschiebungsinterferometer (QLSI), bei dem das Kreuzgitter aus einem Intensitäts-/Phasen-Schachbrettmuster besteht, das von Primot et al. eingeführt und patentiert wurde. im Jahr 200034. Die vertikalen und horizontalen Gitterlinien erzeugen gitterartige Schatten auf dem Sensor, deren Verzerrung in Echtzeit numerisch verarbeitet werden kann, um die optische Wellenfrontverzerrung (oder ein äquivalentes Phasenprofil) des einfallenden Lichts zu erhalten. Bei Verwendung an einem Mikroskop kann eine CGM-Kamera den optischen Gangunterschied eines abgebildeten Objekts, auch optische Tiefe (OT) genannt, mit einer Empfindlichkeit in der Größenordnung von Nanometern anzeigen36. Bei jeder CGM-Messung muss zur Eliminierung etwaiger Defekte in den optischen Komponenten oder Strahlen ein primäres Referenz-OT-Bild aufgenommen und von allen nachfolgenden Bildern subtrahiert werden.
Die Temperaturmikroskopie wurde mit einer CGM-Kamera durchgeführt, wie in der Referenz beschrieben. 32. Kurz gesagt, das Erhitzen einer Flüssigkeit verändert ihren Brechungsindex und erzeugt einen thermischen Linseneffekt, der den einfallenden Strahl verzerrt. Diese Wellenfrontverzerrung wird vom CGM gemessen und mithilfe eines Entfaltungsalgorithmus verarbeitet, um eine dreidimensionale Temperaturverteilung im flüssigen Medium zu erhalten. Wenn die Goldnanopartikel gleichmäßig in der Probe verteilt sind, kann eine Temperaturkartierung in bakterienfreien Bereichen durchgeführt werden, um bessere Bilder zu erzeugen, was wir manchmal tun. Das Referenz-CGM-Bild wurde ohne Erwärmung (bei ausgeschaltetem Laser) aufgenommen und anschließend bei eingeschaltetem Laser an derselben Stelle im Bild erfasst.
Die Messung der Trockenmasse erfolgt mit derselben CGM-Kamera, die auch für die Temperaturbildgebung verwendet wird. CGM-Referenzbilder wurden durch schnelles Bewegen der Probe in x- und y-Richtung während der Belichtung erhalten, um etwaige Inhomogenitäten im OT aufgrund des Vorhandenseins von Bakterien zu mitteln. Aus OT-Bildern von Bakterien wurde ihre Biomasse mithilfe eines Ensembles von Bildern über Bereiche ermittelt, die mit dem hausgemachten Segmentierungsalgorithmus von Matlab ausgewählt wurden (siehe Unterabschnitt „Numerischer Code“), wobei das in Lit. beschriebene Verfahren befolgt wurde. 48. Kurz gesagt verwenden wir die Beziehung \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), wobei \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) das optische Tiefenbild ist, \(m\) ist das Trockengewicht und \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) ist eine Konstante. Wir haben \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg gewählt, was eine typische Konstante für lebende Zellen ist.
Ein mit Goldnanopartikeln beschichtetes Deckglas mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Dicke von 150 µm wurde mit den Goldnanopartikeln nach oben in eine AttofluorTM-Kammer (Thermofisher) gelegt. Geobacillus stearothermophilus wurde vor jedem Versuchstag über Nacht in LB-Medium (200 U/min, 60 °C) vorkultiviert. Ein Tropfen von 5 µl einer Suspension von G. stearothermophilus mit einer optischen Dichte (OD) von 0,3 bis 0,5 wurde auf ein Deckglas mit Goldnanopartikeln gegeben. Anschließend wurde ein rundes Deckglas mit 18 mm Durchmesser und einem Loch von 5 mm Durchmesser in der Mitte auf den Tropfen getropft und wiederholt 5 μl Bakteriensuspension mit der gleichen optischen Dichte in die Mitte des Lochs aufgetragen. Die Vertiefungen auf Deckgläsern wurden gemäß dem in Lit. beschriebenen Verfahren vorbereitet. 45 (siehe Ergänzende Informationen für weitere Informationen). Fügen Sie dann 1 ml LB-Medium zum Deckglas hinzu, um ein Austrocknen der Flüssigkeitsschicht zu verhindern. Das letzte Deckglas wird über den geschlossenen Deckel der Attofluor™-Kammer gelegt, um eine Verdunstung des Mediums während der Inkubation zu verhindern. Für Keimungsexperimente verwendeten wir Sporen, die nach konventionellen Experimenten manchmal das obere Deckglas bedeckten. Eine ähnliche Methode wurde zur Gewinnung von Sulfolobus shibatae verwendet. Drei Tage (200 U/min, 75 °C) der Vorkultivierung von Thiobacillus serrata wurden in Medium 182 (DSMZ) durchgeführt.
Proben von Goldnanopartikeln wurden durch mizellare Blockcopolymer-Lithographie hergestellt. Dieser Vorgang wird in Kap. ausführlich beschrieben. 60. Kurz gesagt, Mizellen, die Goldionen einkapseln, wurden durch Mischen des Copolymers mit HAuCl4 in Toluol synthetisiert. Die gereinigten Deckgläser wurden dann in die Lösung getaucht und in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit UV-Bestrahlung behandelt, um Goldkeime zu erhalten. Schließlich wurden Goldkeime gezüchtet, indem ein Deckglas 16 Minuten lang mit einer wässrigen Lösung aus KAuCl4 und Ethanolamin in Kontakt gebracht wurde, was zu einer quasiperiodischen und sehr gleichmäßigen Anordnung nicht kugelförmiger Goldnanopartikel im nahen Infrarot führte.
Um die Interferogramme in OT-Bilder umzuwandeln, verwendeten wir einen hausgemachten Algorithmus, wie im Link beschrieben. 33 und ist als Matlab-Paket im folgenden öffentlichen Repository verfügbar: https://github.com/baffou/CGMprocess. Das Paket kann Intensitäts- und OT-Bilder basierend auf aufgezeichneten Interferogrammen (einschließlich Referenzbildern) und Kamera-Array-Abständen berechnen.
Um das auf SLM angewendete Phasenmuster zu berechnen, um ein bestimmtes Temperaturprofil zu erhalten, haben wir einen zuvor entwickelten hausgemachten Algorithmus39,42 verwendet, der im folgenden öffentlichen Repository verfügbar ist: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Als Eingabe dient das gewünschte Temperaturfeld, das digital oder über ein monochromes BMP-Bild eingestellt werden kann.
Um die Zellen zu segmentieren und ihr Trockengewicht zu messen, haben wir unseren Matlab-Algorithmus verwendet, der im folgenden öffentlichen Repository veröffentlicht ist: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Auf jedem Bild muss der Benutzer auf die interessierenden Bakterien oder mCFU klicken, die Empfindlichkeit des Stabs anpassen und die Auswahl bestätigen.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Research Report, die mit diesem Artikel verlinkt ist.
Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den jeweiligen Autoren erhältlich.
Der in dieser Studie verwendete Quellcode wird im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben. Debugversionen können von https://github.com/baffou/ in den folgenden Repositories heruntergeladen werden: SLM_temperatureShaping, CGMprocess und CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Einblick in Thermophile und ihre Breitbandanwendungen. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Einblick in Thermophile und ihre Breitbandanwendungen.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. und Sharma, AK Überblick über Thermophile und ihre breite Anwendung. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. und Sharma AK Ein tiefes Verständnis von Thermophilen und einem breiten Anwendungsspektrum.3 Biotechnologie 6, 81 (2016).
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 26.09.2022