Der Alzheimer-Krankheit (AD) fehlen Protein-Biomarker, die die vielfältige zugrunde liegende Pathophysiologie widerspiegeln, was den Fortschritt von Diagnose und Behandlung behindert. Hier verwenden wir umfassende Proteomik, um Biomarker der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) zu identifizieren, die ein breites Spektrum der AD-Pathophysiologie repräsentieren. Multiplex-Massenspektrometrie identifizierte etwa 3.500 bzw. etwa 12.000 Proteine im AD-Liquor und im Gehirn. Die Netzwerkanalyse des Gehirnproteoms löste 44 Biodiversitätsmodule auf, von denen 15 mit dem Proteom der Liquor cerebrospinalis überlappten. Die CSF-AD-Marker in diesen überlappenden Modulen sind in fünf Proteingruppen gefaltet, die unterschiedliche pathophysiologische Prozesse darstellen. Die Synapsen und Metaboliten im AD-Gehirn nehmen ab, aber der Liquor nimmt zu, während die glialen Myelinisierungs- und Immungruppen im Gehirn und im Liquor zunehmen. Die Konsistenz und Krankheitsspezifität der Panel-Änderungen wurde in mehr als 500 weiteren Liquorproben bestätigt. Diese Gruppen identifizierten auch biologische Untergruppen bei asymptomatischer AD. Insgesamt sind diese Ergebnisse ein vielversprechender Schritt hin zu webbasierten Biomarker-Tools für klinische Anwendungen bei AD.
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist weltweit die häufigste Ursache für neurodegenerative Demenz und ist durch eine Vielzahl von Funktionsstörungen des biologischen Systems gekennzeichnet, darunter synaptische Übertragung, gliale-vermittelte Immunität und mitochondrialer Stoffwechsel (1-3). Allerdings konzentrieren sich die etablierten Proteinbiomarker immer noch auf den Nachweis von Amyloid- und Tau-Protein und können daher diese vielfältige Pathophysiologie nicht widerspiegeln. Zu diesen „Kern“-Protein-Biomarkern, die am zuverlässigsten in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) gemessen werden können, gehören (i) das Amyloid-Beta-Peptid 1-42 (Aβ1-42), das die Bildung kortikaler Amyloid-Plaques widerspiegelt; (ii) Gesamt-Tau, ein Zeichen einer Axon-Degeneration; (iii) Phospho-Tau (p-Tau), ein Vertreter der pathologischen Tau-Hyperphosphorylierung (4-7). Obwohl diese Liquor-Biomarker unsere Erkennung von „markierten“ AD-Protein-Erkrankungen (4-7) erheblich erleichtert haben, stellen sie nur einen kleinen Teil der komplexen Biologie dar, die der Krankheit zugrunde liegt.
Der Mangel an pathophysiologischer Vielfalt von AD-Biomarkern hat zu vielen Herausforderungen geführt, darunter (i) die Unfähigkeit, die biologische Heterogenität von AD-Patienten zu identifizieren und zu quantifizieren, (ii) unzureichende Messung der Schwere und des Fortschreitens der Erkrankung, insbesondere im präklinischen Stadium, und ( iii) die Entwicklung therapeutischer Medikamente, die nicht alle Aspekte der neurologischen Verschlechterung vollständig lösen konnten. Unsere Abhängigkeit von der wegweisenden Pathologie zur Beschreibung von AD aufgrund verwandter Krankheiten verschärft diese Probleme nur. Immer mehr Beweise zeigen, dass die meisten älteren Menschen mit Demenz mehr als ein pathologisches Merkmal des kognitiven Verfalls aufweisen (8). Bis zu 90 % oder mehr der Personen mit AD-Pathologie leiden auch an Gefäßerkrankungen, TDP-43-Einschlüssen oder anderen degenerativen Erkrankungen (9). Diese hohen Anteile pathologischer Überschneidungen haben unseren aktuellen diagnostischen Rahmen für Demenz durcheinander gebracht und eine umfassendere pathophysiologische Definition der Krankheit ist erforderlich.
Angesichts des dringenden Bedarfs an einer Vielzahl von AD-Biomarkern wendet das Fachgebiet zunehmend die „Omics“-Methode an, die auf dem Gesamtsystem zur Entdeckung von Biomarkern basiert. Die Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance wurde 2014 ins Leben gerufen und steht an der Spitze des Programms. Diese multidisziplinäre Anstrengung der National Institutes of Health, der Wissenschaft und der Industrie zielt darauf ab, systembasierte Strategien zu nutzen, um die Pathophysiologie von AD besser zu definieren und diagnostische Analyse- und Behandlungsstrategien für die Biodiversität zu entwickeln (10). Im Rahmen dieses Projekts hat sich die Netzwerkproteomik zu einem vielversprechenden Instrument für die Weiterentwicklung systembasierter Biomarker bei Alzheimer entwickelt. Dieser unvoreingenommene datengesteuerte Ansatz organisiert komplexe Proteomik-Datensätze in Gruppen oder „Modulen“ koexprimierter Proteine, die mit bestimmten Zelltypen, Organellen und biologischen Funktionen verbunden sind (11–13). Fast 12 informationsreiche Netzwerk-Proteomik-Studien wurden am AD-Gehirn durchgeführt (13-23). Insgesamt deuten diese Analysen darauf hin, dass das AD-Gehirnnetzwerk-Proteom in unabhängigen Kohorten und mehreren kortikalen Regionen eine hochkonservierte modulare Organisation aufweist. Darüber hinaus zeigen einige dieser Module reproduzierbare Veränderungen in der AD-bedingten Häufigkeit über Datensätze hinweg, was die Pathophysiologie mehrerer Krankheiten widerspiegelt. Zusammenfassend stellen diese Ergebnisse einen vielversprechenden Ankerpunkt für die Entdeckung des Gehirnnetzwerk-Proteoms als systembasierten Biomarker bei AD dar.
Um das Proteom des AD-Gehirnnetzwerks in klinisch nützliche systembasierte Biomarker umzuwandeln, haben wir das aus dem Gehirn abgeleitete Netzwerk mit der proteomischen Analyse des AD-CSF kombiniert. Dieser integrierte Ansatz führte zur Identifizierung von fünf vielversprechenden Sätzen von CSF-Biomarkern, die mit einem breiten Spektrum gehirnbasierter Pathophysiologie verbunden sind, darunter Synapsen, Blutgefäße, Myelinisierung, Entzündung und Funktionsstörung von Stoffwechselwegen. Wir haben diese Biomarker-Panels erfolgreich durch mehrere Replikationsanalysen validiert, darunter mehr als 500 Liquorproben verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen. Diese Validierungsanalysen umfassen die Untersuchung von Gruppenzielen im Liquor von Patienten mit asymptomatischer AD (AsymAD) oder den Nachweis von Hinweisen auf eine abnormale Amyloidakkumulation in einer normalen kognitiven Umgebung. Diese Analysen verdeutlichen die erhebliche biologische Heterogenität in der AsymAD-Population und identifizieren Panel-Marker, die möglicherweise in der Lage sind, Personen in den frühesten Stadien der Krankheit zu subtypisieren. Insgesamt stellen diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in der Entwicklung von Protein-Biomarker-Tools dar, die auf mehreren Systemen basieren und viele der klinischen Herausforderungen, mit denen AD konfrontiert ist, erfolgreich lösen können.
Der Hauptzweck dieser Studie besteht darin, neue Biomarker für die Liquor cerebrospinalis zu identifizieren, die verschiedene gehirnbasierte Pathophysiologien widerspiegeln, die zu AD führen. Abb flüssige Kohorten. Die entdeckungsorientierte Forschung begann mit der Analyse der unterschiedlichen Expression von Liquor bei 20 kognitiv normalen Personen und 20 AD-Patienten am Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). Die Diagnose AD ist definiert als eine signifikante kognitive Beeinträchtigung bei niedrigem Aβ1-42 und erhöhten Werten von Gesamt-Tau und p-Tau in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA). )]] (Tabelle S1A). Die Kontrolle (mittlerer MoCA 26,7 ± 2,2) wies normale Werte an CSF-Biomarkern auf.
Menschlicher Liquor zeichnet sich durch einen dynamischen Bereich der Proteinhäufigkeit aus, in dem Albumin und andere extrem häufig vorkommende Proteine den Nachweis interessierender Proteine verhindern können (24). Um die Tiefe der Proteinentdeckung zu erhöhen, haben wir vor der Massenspektrometrieanalyse (MS) die ersten 14 sehr häufig vorkommenden Proteine aus jeder CSF-Probe entfernt (24). Durch MS wurden insgesamt 39.805 Peptide identifiziert, die in 40 Proben auf 3691 Proteome kartiert wurden. Die Proteinquantifizierung erfolgt durch Mehrfach-Tandem-Mass-Tag-Markierung (TMT) (18, 25). Um die fehlenden Daten aufzulösen, haben wir in die anschließende Analyse nur diejenigen Proteine einbezogen, die in mindestens 50 % der Proben quantifiziert wurden, und so letztendlich 2875 Proteome quantifiziert. Aufgrund des signifikanten Unterschieds in der Gesamtproteinhäufigkeit wurde eine Kontrollprobe statistisch als Ausreißer angesehen (13) und nicht in die anschließende Analyse einbezogen. Die Häufigkeitswerte der verbleibenden 39 Proben wurden entsprechend Alter, Geschlecht und Chargenkovarianz angepasst (13-15, 17, 18, 20, 26).
Unter Verwendung einer statistischen T-Test-Analyse zur Bewertung der unterschiedlichen Expression im Regressionsdatensatz identifizierte diese Analyse Proteine, deren Häufigkeitsniveaus zwischen den Kontroll- und AD-Fällen signifikant verändert waren (P <0,05) (Tabelle S2A). Wie in Abbildung 1A dargestellt, war die Häufigkeit von insgesamt 225 Proteinen in AD deutlich reduziert und die Häufigkeit von 303 Proteinen deutlich erhöht. Zu diesen unterschiedlich exprimierten Proteinen gehören mehrere zuvor identifizierte AD-Marker in der Liquor cerebrospinalis, wie z. B. Mikrotubuli-assoziiertes Protein Tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), Neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3) und wachstumsbezogenes Protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Chitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) und VGF-Nervenwachstumsfaktor (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4–6). Wir haben jedoch auch andere sehr wichtige Ziele identifiziert, wie den GDP-Dissoziationsinhibitor 1 (GDI1; P = 1,54 × 10–10) und SPARC-bezogene modulare Kalziumbindung 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10–9). Die Analyse der Genontologie (GO) von 225 signifikant reduzierten Proteinen ergab enge Zusammenhänge mit Körperflüssigkeitsprozessen wie dem Steroidstoffwechsel, der Blutgerinnung und der Hormonaktivität (Abbildung 1B und Tabelle S2B). Im Gegensatz dazu steht das deutlich erhöhte Protein von 303 in engem Zusammenhang mit der Zellstruktur und dem Energiestoffwechsel.
(A) Das Vulkandiagramm zeigt die log2-fache Änderung (x-Achse) relativ zum statistischen -log10-P-Wert (y-Achse), der durch den t-Test erhalten wurde und zur Erkennung der unterschiedlichen Expression zwischen der Kontrolle (CT) und verwendet wird AD-Fälle des CSF-Proteoms aller Proteine. Proteine mit deutlich reduzierten Werten (P < 0,05) bei AD sind blau dargestellt, während Proteine mit deutlich erhöhten Werten bei Erkrankungen rot dargestellt sind. Das ausgewählte Protein wird markiert. (B) Die wichtigsten GO-Begriffe im Zusammenhang mit Protein sind bei AD deutlich reduziert (blau) und erhöht (rot). Zeigt die drei GO-Begriffe mit den höchsten Z-Scores in den Bereichen biologische Prozesse, molekulare Funktionen und zelluläre Komponenten. (C) MS hat den MAPT-Spiegel in der CSF-Probe gemessen (links) und seine Korrelation mit dem ELISA-Tau-Spiegel der Probe (rechts). Der Pearson-Korrelationskoeffizient mit dem relevanten P-Wert wird angezeigt. Aufgrund fehlender ELISA-Daten für einen AD-Fall sind in diesen Zahlen Werte für 38 der 39 analysierten Fälle enthalten. (D) Überwachte Clusteranalyse (P < 0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) angepasstes P < 0,01) der Kontroll- und AD-CSF-Proben mit den 65 am stärksten veränderten Proteinen im Datensatz. Standardisieren, normalisieren.
Der proteomische Wert von MAPT steht in engem Zusammenhang mit dem unabhängig gemessenen ELISA-Tau-Wert (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Abbildung 1C), was die Gültigkeit unserer MS-Messung unterstützt. Nach der Trypsin-Verdauung auf der Ebene des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) können die isoformspezifischen Peptide, die am C-Terminus von Aβ1-40 und Aβ1-42 kartiert sind, nicht effizient ionisiert werden (27, 28). Daher haben die von uns identifizierten APP-Peptide nichts mit den Aβ1-42-Spiegeln im ELISA zu tun. Um die unterschiedliche Expression jedes einzelnen Falles zu bewerten, verwendeten wir differenziell exprimierte Proteine mit P <0,0001 [falsche Entdeckungsrate (FDR) korrigiertes P <0,01], um eine überwachte Clusteranalyse der Proben durchzuführen (Tabelle S2A). Wie in Abbildung 1D dargestellt, können diese 65 hochsignifikanten Proteine Proben entsprechend dem Krankheitszustand korrekt gruppieren, mit Ausnahme eines AD-Falls mit kontrollähnlichen Merkmalen. Von diesen 65 Proteinen stiegen 63 bei AD an, während nur zwei (CD74 und ISLR) abnahmen. Insgesamt haben diese Analysen der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit Hunderte von Proteinen bei AD identifiziert, die als Krankheitsbiomarker dienen könnten.
Anschließend führten wir eine unabhängige Netzwerkanalyse des AD-Gehirnproteoms durch. Die Gehirnkohorte dieser Entdeckung umfasste dorsolateralen präfrontalen Kortex (DLPFC) aus Kontrollfällen (n = 10), Parkinson-Krankheit (PD; n = 10), gemischten AD/PD-Fällen (n = 10) und AD-Fällen (n = 10). ) Probe. Emery Goizueta ADRC. Die demografischen Merkmale dieser 40 Fälle wurden bereits beschrieben (25) und sind in Tabelle S1B zusammengefasst. Wir verwendeten TMT-MS, um diese 40 Gehirngewebe und die Replikationskohorte von 27 Fällen zu analysieren. Insgesamt produzierten diese beiden Gehirndatensätze 227.121 einzigartige Peptide, die 12.943 Proteomen zugeordnet wurden (25). In die weiteren Untersuchungen wurden nur solche Proteine einbezogen, die in mindestens 50 % der Fälle quantifiziert wurden. Der endgültige Entdeckungsdatensatz enthält 8817 quantifizierte Proteine. Passen Sie die Proteinhäufigkeit basierend auf Alter, Geschlecht und Post-Mortem-Intervall (PMI) an. Die differenzielle Expressionsanalyse des Datensatzes nach der Regression zeigte, dass > 2000 Proteinspiegel in zwei oder mehr Krankheitskohorten signifikant verändert waren [P < 0,05, Varianzanalyse (ANOVA)]. Anschließend führten wir eine überwachte Clusteranalyse basierend auf den unterschiedlich exprimierten Proteinen und einem P <0,0001 in AD/Kontroll- und/oder AD/PD-Vergleichen durch (Abbildung S2, A und B, Tabelle S2C). Diese 165 stark veränderten Proteine zeigen deutlich Fälle mit AD-Pathologie aus den Kontroll- und PD-Proben und bestätigen die starken AD-spezifischen Veränderungen im gesamten Proteom.
Anschließend verwendeten wir einen Algorithmus namens Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), um eine Netzwerkanalyse des entdeckten Gehirnproteoms durchzuführen, die den Datensatz in Proteinmodule mit ähnlichen Expressionsmustern organisiert (11-13). Die Analyse identifizierte 44 Module (M) coexprimierte Proteine, sortiert und nummeriert vom größten (M1, n = 1821 Proteine) bis zum kleinsten (M44, n = 34 Proteine) (Abbildung 2A und Tabelle S2D). Wie oben erwähnt (13) Berechnen Sie das repräsentative Expressionsprofil oder charakteristische Protein jedes Moduls und korrelieren Sie es mit dem Krankheitszustand und der AD-Pathologie, d. h. stellen Sie die Allianz zwischen dem Alzheimer-Krankheitsregister (CERAD) und dem Braak-Score her (Abbildung 2B). Insgesamt standen 17 Module in signifikantem Zusammenhang mit der AD-Neuropathologie (P <0,05). Viele dieser krankheitsbezogenen Module sind auch reich an zelltypspezifischen Markern (Abbildung 2B). Wie oben erwähnt (13), wird die Zelltypanreicherung durch die Analyse der Modulüberlappung und der Referenzliste zelltypspezifischer Gene bestimmt. Diese Gene stammen aus veröffentlichten Daten in isolierten Mausneuronen, Endothel- und Gliazellen. Experiment zur RNA-Sequenzierung (RNA-seq) (29).
(A) Entdecken Sie die WGCNA des Gehirnproteoms. (B) Biweight Midcorrelation (BiCor)-Analyse des modularen Signaturproteins (der ersten Hauptkomponente der modularen Proteinexpression) mit neuropathologischen AD-Merkmalen (oben), einschließlich CERAD- (Aβ-Plaque) und Braak- (Tau-Tangles) Scores. Die Intensitäten positiver (rot) und negativer (blau) Korrelationen werden durch eine zweifarbige Wärmekarte angezeigt, und Sternchen geben die statistische Signifikanz an (P <0,05). Verwenden Sie den hypergeometrischen Fisher's Exact Test (FET) (unten), um die Zelltypassoziation jedes Proteinmoduls zu beurteilen. Die Intensität der roten Schattierung gibt den Grad der Zelltypanreicherung an, und das Sternchen gibt die statistische Signifikanz an (P <0,05). Verwenden Sie die BH-Methode, um den vom FET abgeleiteten P-Wert zu korrigieren. (C) GO-Analyse modularer Proteine. Für jedes Modul bzw. jede zugehörige Modulgruppe werden die am engsten zusammenhängenden biologischen Prozesse dargestellt. Oligo, Oligodendrozyten.
Ein Satz von fünf eng verwandten Astrozyten- und Mikroglia-reichen Modulen (M30, M29, M18, M24 und M5) zeigte eine starke positive Korrelation mit der AD-Neuropathologie (Abbildung 2B). Die Ontologieanalyse verknüpft diese Gliamodule mit Zellwachstum, Zellproliferation und Immunität (Abbildung 2C und Tabelle S2E). Zwei weitere Gliamodule, M8 und M22, sind bei Erkrankungen ebenfalls stark hochreguliert. M8 steht in engem Zusammenhang mit dem Toll-like-Rezeptor-Signalweg, einer Signalkaskade, die eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunantwort spielt (30). Gleichzeitig steht M22 in engem Zusammenhang mit der posttranslationalen Modifikation. M2, das reich an Oligodendrozyten ist, zeigt eine starke positive Korrelation mit der AD-Pathologie und einen ontologischen Zusammenhang mit der Nukleosidsynthese und DNA-Replikation, was auf eine verstärkte Zellproliferation bei Krankheiten hinweist. Insgesamt stützen diese Ergebnisse die Erhöhung der Gliamodule, die wir zuvor im AD-Netzwerk-Proteom beobachtet haben (13, 17). Derzeit wurde festgestellt, dass viele AD-bezogene Gliamodule im Netzwerk in Kontroll- und PD-Fällen geringere Expressionsniveaus aufweisen, was ihre Krankheitsspezifität unterstreicht, die bei AD erhöht ist (Abbildung S2C).
Nur vier Module in unserem Netzwerkproteom (M1, M3, M10 und M32) korrelieren stark negativ mit der AD-Pathologie (P <0,05) (Abbildung 2, B und C). Sowohl M1 als auch M3 sind reich an neuronalen Markern. M1 steht in engem Zusammenhang mit synaptischen Signalen, während M3 eng mit der Mitochondrienfunktion zusammenhängt. Für M10 und M32 gibt es keine Hinweise auf eine Zelltypanreicherung. M32 spiegelt den Zusammenhang zwischen M3 und dem Zellstoffwechsel wider, während M10 stark mit dem Zellwachstum und der Mikrotubulifunktion zusammenhängt. Im Vergleich zu AD sind bei allen vier Modulen die Kontrolle und die Parkinson-Krankheit erhöht, was zu krankheitsspezifischen AD-Veränderungen führt (Abbildung S2C). Insgesamt stützen diese Ergebnisse die verringerte Häufigkeit neuronenreicher Module, die wir zuvor bei AD beobachtet haben (13, 17). Zusammenfassend ergab die von uns entdeckte Netzwerkanalyse des Gehirnproteoms AD-spezifisch veränderte Module, die mit unseren vorherigen Erkenntnissen übereinstimmen.
AD ist durch ein frühes asymptomatisches Stadium (AsymAD) gekennzeichnet, in dem Personen eine Amyloidansammlung ohne klinischen kognitiven Rückgang aufweisen (5, 31). Dieses asymptomatische Stadium stellt ein kritisches Fenster für die Früherkennung und Intervention dar. Wir haben zuvor eine starke modulare Erhaltung des AsymAD- und AD-Gehirnnetzwerkproteoms über unabhängige Datensätze hinweg nachgewiesen (13, 17). Um sicherzustellen, dass das von uns aktuell entdeckte Gehirnnetzwerk mit diesen früheren Erkenntnissen übereinstimmt, haben wir die Erhaltung von 44 Modulen im replizierten Datensatz von 27 DLPFC-Organisationen analysiert. Diese Organisationen umfassen Kontrollfälle (n = 10), AsymAD-Fälle (n = 8) und AD-Fälle (n = 9). Kontroll- und AD-Proben wurden in die Analyse unserer Entdeckungskohorte einbezogen (Tabelle S1B), während AsymAD-Fälle nur in der Replikationskohorte einzigartig waren. Diese AsymAD-Fälle stammten auch von der Emory Goizueta ADRC-Gehirnbank. Obwohl die Wahrnehmung zum Zeitpunkt des Todes normal war, waren die Amyloidwerte ungewöhnlich hoch (mittlerer CERAD 2,8 ± 0,5) (Tabelle S1B).
Die TMT-MS-Analyse dieser 27 Gehirngewebe führte zur Quantifizierung von 11.244 Proteomen. Diese Endzählung umfasst nur die Proteine, die in mindestens 50 % der Proben quantifiziert wurden. Dieser replizierte Datensatz enthält 8638 (98,0 %) der 8817 Proteine, die in unserer Entdeckungshirnanalyse entdeckt wurden, und weist fast 3000 signifikant veränderte Proteine zwischen der Kontroll- und der AD-Kohorte auf (P <0,05, nach Tukeys gepaartem t-Test zur Varianzanalyse) ( Tabelle S2F). Unter diesen unterschiedlich exprimierten Proteinen zeigten 910 auch signifikante Niveauveränderungen zwischen AD- und Hirnproteom-Kontrollfällen (P < 0,05, nach ANOVA Tukey gepaarter t-Test). Es ist erwähnenswert, dass diese 910 Marker in der Richtung der Änderung zwischen Proteomen sehr konsistent sind (r = 0,94, P <1,0 × 10–200) (Abbildung S3A). Unter den erhöhten Proteinen sind die Proteine mit den konsistentesten Veränderungen zwischen Datensätzen hauptsächlich Mitglieder der glialen M5- und M18-Module (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 und GFAP). Unter den reduzierten Proteinen waren diejenigen mit den konsistentesten Veränderungen fast ausschließlich Mitglieder des M1-Moduls (NPTX2, VGF und RPH3A), das mit der Synapse assoziiert ist. Wir haben die AD-bedingten Veränderungen von Midkine (MDK), CD44, sekretiertem Frizzled-Related Protein 1 (SFRP1) und VGF durch Western Blot weiter verifiziert (Abbildung S3B). Die Modulkonservierungsanalyse zeigte, dass etwa 80 % der Proteinmodule (34/44) im Gehirnproteom im Replikationsdatensatz signifikant konserviert waren (Z-Score > 1,96, FDR-korrigiertes P <0,05) (Abbildung S3C). Vierzehn dieser Module waren speziell zwischen den beiden Proteomen reserviert (Z-Score > 10, FDR-korrigiertes P <1,0 × 10−23). Insgesamt unterstreicht die Entdeckung und Replikation des hohen Maßes an Konsistenz in der differentiellen Expression und der modularen Zusammensetzung zwischen dem Gehirnproteom die Reproduzierbarkeit der Veränderungen in AD-Frontalkortexproteinen. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass AsymAD und fortgeschrittenere Krankheiten eine sehr ähnliche Gehirnnetzwerkstruktur aufweisen.
Eine detailliertere Analyse der differentiellen Expression im Gehirnreplikationsdatensatz verdeutlicht den signifikanten Grad an AsymAD-Proteinveränderungen, einschließlich insgesamt 151 signifikant veränderten Proteinen zwischen AsymAD und der Kontrolle (P <0,05) (Abbildung S3D). Im Einklang mit der Amyloidbelastung stieg APP im Gehirn von AsymAD und AD signifikant an. MAPT verändert sich nur bei AD signifikant, was mit einem erhöhten Grad an Tangles und der bekannten Korrelation mit dem kognitiven Rückgang übereinstimmt (5, 7). Die glialen Module (M5 und M18) spiegeln sich stark in den erhöhten Proteinen in AsymAD wider, während das neuronenbezogene M1-Modul das repräsentativste der verringerten Proteine in AsymAD ist. Viele dieser AsymAD-Marker zeigen größere Veränderungen bei symptomatischen Erkrankungen. Zu diesen Markern gehört SMOC1, ein zu M18 gehörendes Gliaprotein, das mit Hirntumoren und der Entwicklung von Augen und Gliedmaßen assoziiert ist (32). MDK ist ein Heparin-bindender Wachstumsfaktor, der mit Zellwachstum und Angiogenese zusammenhängt (33), ein weiteres Mitglied von M18. Im Vergleich zur Kontrollgruppe stieg AsymAD deutlich an, gefolgt von einem stärkeren Anstieg von AD. Im Gegensatz dazu war das synaptische Protein Neuropentraxin 2 (NPTX2) im AsymAD-Gehirn deutlich reduziert. NPTX2 wurde früher mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht und spielt eine anerkannte Rolle bei der Vermittlung erregender Synapsen (34). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine Vielzahl unterschiedlicher präklinischer Proteinveränderungen bei AD, die offenbar mit der Schwere der Erkrankung fortschreiten.
Da wir bei der Entdeckung des Gehirnproteoms eine erhebliche Tiefe der Proteinabdeckung erreicht haben, versuchen wir, seine Überlappung mit dem AD-Transkriptom auf Netzwerkebene besser zu verstehen. Daher verglichen wir das von uns entdeckte Gehirnproteom mit dem Modul, das wir zuvor aus der Microarray-Messung von 18.204 Genen in AD- (n = 308) und Kontroll-DLPFC-Geweben (n = 157) generiert hatten (13). überlappend. Insgesamt identifizierten wir 20 verschiedene RNA-Module, von denen viele die Anreicherung spezifischer Zelltypen zeigten, darunter Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia (Abbildung 3A). Die zahlreichen Änderungen dieser Module in AD sind in Abbildung 3B dargestellt. In Übereinstimmung mit unserer vorherigen Protein-RNA-Überlappungsanalyse unter Verwendung des tieferen unmarkierten MS-Proteoms (etwa 3000 Proteine) (13) befinden sich die meisten der 44 Module im Gehirn-Proteom-Netzwerk, die wir gefunden haben, im Transkriptom-Netzwerk. Es gibt keine signifikante Überlappung in. Selbst in Bei unserer Entdeckung und Replikation der 34 Proteinmodule, die im Gehirnproteom stark zurückgehalten werden, bestanden nur 14 (~40 %) den exakten Fisher-Test (FET) und zeigten eine statistisch signifikante Überlappung mit dem Transkriptom (Abbildung 3A). Kompatibel mit DNA-Schadensreparatur (P-M25 und P-M19), Proteintranslation (P-M7 und P-M20), RNA-Bindung/Spleißen (P-M16 und P-M21) und Protein-Targeting (P-M13 und P-M21). M23) überschneidet sich nicht mit Modulen im Transkriptom. Obwohl in der aktuellen Überlappungsanalyse ein tieferer Proteomdatensatz verwendet wird (13), wird daher der größte Teil des AD-Netzwerkproteoms nicht dem Transkriptomnetzwerk zugeordnet.
(A) Hypergeometrischer FET zeigt die Anreicherung zelltypspezifischer Marker im RNA-Modul des AD-Transkriptoms (oben) und den Grad der Überlappung zwischen den RNA-Modulen (x-Achse) und Proteinmodulen (y-Achse) des AD-Gehirns (unten) . Die Intensität der roten Schattierung zeigt den Grad der Anreicherung der Zelltypen im oberen Feld und die Intensität der Überlappung der Module im unteren Feld an. Sternchen geben die statistische Signifikanz an (P <0,05). (B) Der Grad der Korrelation zwischen den charakteristischen Genen jedes Transkriptommoduls und dem AD-Status. Die Module auf der linken Seite korrelieren am negativsten mit AD (blau), und die Module auf der rechten Seite korrelieren am positivsten mit AD (rot). Der logarithmisch transformierte BH-korrigierte P-Wert gibt den Grad der statistischen Signifikanz jeder Korrelation an. (C) Signifikante überlappende Module mit gemeinsamer Zelltypanreicherung. (D) Korrelationsanalyse der log2-fachen Änderung des markierten Proteins (x-Achse) und der RNA (y-Achse) im überlappenden Modul. Der Pearson-Korrelationskoeffizient mit dem relevanten P-Wert wird angezeigt. Mikro, Mikroglia; Himmelskörper, Astrozyten. CT, Kontrolle.
Die meisten überlappenden Protein- und RNA-Module weisen ähnliche Zelltyp-Anreicherungsprofile und konsistente AD-Änderungsrichtungen auf (Abbildung 3, B und C). Mit anderen Worten: Das synapsenbezogene M1-Modul des Gehirnproteoms (PM1) wird auf drei neuronenreiche homologe RNA-Module (R-M1, R-M9 und R-M16) abgebildet, die in AD beide gezeigt wurden ein reduziertes Niveau. In ähnlicher Weise überlappen die glialen M5- und M18-Proteinmodule mit RNA-Modulen, die reich an Astrozyten und Mikroglia-Markern sind (R-M3, R-M7 und R-M10) und sind stark an der Zunahme von Krankheiten beteiligt. Diese gemeinsamen modularen Merkmale der beiden Datensätze unterstützen die Zelltypanreicherung und die krankheitsbedingten Veränderungen, die wir im Gehirnproteom beobachtet haben. Wir beobachteten jedoch viele signifikante Unterschiede zwischen den RNA- und Proteingehalten einzelner Marker in diesen gemeinsam genutzten Modulen. Die Korrelationsanalyse der unterschiedlichen Expression der Proteomik und Transkriptomik der Moleküle innerhalb dieser überlappenden Module (Abbildung 3D) verdeutlicht diese Inkonsistenz. Beispielsweise zeigten APP und mehrere andere Gliamodulproteine (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 und SFRP1) einen signifikanten Anstieg im AD-Proteom, aber es gab fast keine Veränderung im AD-Transkriptom. Diese proteinspezifischen Veränderungen stehen möglicherweise in engem Zusammenhang mit Amyloid-Plaques (23, 35), was das Proteom als Quelle pathologischer Veränderungen hervorhebt, und diese Veränderungen spiegeln sich möglicherweise nicht im Transkriptom wider.
Nachdem wir die von uns entdeckten Gehirn- und Liquor-Proteome unabhängig voneinander analysiert hatten, führten wir eine umfassende Analyse der beiden Datensätze durch, um AD-Liquor-Biomarker zu identifizieren, die mit der Pathophysiologie des Gehirnnetzwerks zusammenhängen. Wir müssen zunächst die Überlappung der beiden Proteome definieren. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass der Liquor neurochemische Veränderungen im AD-Gehirn widerspiegelt (4), ist der genaue Grad der Überlappung zwischen dem AD-Gehirn und dem Liquor-Proteom unklar. Durch den Vergleich der Anzahl gemeinsamer Genprodukte, die in unseren beiden Proteomen nachgewiesen wurden, stellten wir fest, dass fast 70 % (n = 1936) der im Liquor identifizierten Proteine auch im Gehirn quantifiziert wurden (Abbildung 4A). Die meisten dieser überlappenden Proteine (n = 1721) werden einem von 44 Koexpressionsmodulen aus dem Discovery-Gehirn-Datensatz zugeordnet (Abbildung 4B). Wie erwartet zeigten die sechs größten Gehirnmodule (M1 bis M6) die größte Liquorüberlappung. Es gibt jedoch kleinere Gehirnmodule (z. B. M15 und M29), die einen unerwartet hohen Grad an Überlappung erreichen, der größer ist als ein Gehirnmodul, das doppelt so groß ist. Dies motiviert uns, eine detailliertere, statistisch gesteuerte Methode zur Berechnung der Überlappung zwischen Gehirn und Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit anzuwenden.
(A und B) Die in den Discovery-Gehirn- und CSF-Datensätzen erkannten Proteine überschneiden sich. Die meisten dieser überlappenden Proteine sind mit einem der 44 Koexpressionsmodule des Gehirn-Koexpressionsnetzwerks verbunden. (C) Entdecken Sie die Überlappung zwischen dem Proteom der Liquor cerebrospinalis und dem Proteom des Gehirnnetzwerks. Jede Zeile der Wärmekarte stellt eine separate Überlappungsanalyse des hypergeometrischen FET dar. Die obere Reihe zeigt die Überlappung (grau/schwarze Schattierung) zwischen dem Gehirnmodul und dem gesamten CSF-Proteom. Die zweite Zeile zeigt, dass die Überlappung zwischen Gehirnmodulen und CSF-Protein (rot schattiert) bei AD deutlich hochreguliert ist (P <0,05). Die dritte Zeile zeigt, dass die Überlappung zwischen Gehirnmodulen und CSF-Protein (blaue Schattierung) bei AD deutlich herunterreguliert ist (P <0,05). Verwenden Sie die BH-Methode, um den vom FET abgeleiteten P-Wert zu korrigieren. (D) Faltmodulpanel basierend auf Zelltypzuordnung und verwandten GO-Begriffen. Diese Panels enthalten insgesamt 271 gehirnbezogene Proteine, die im CSF-Proteom eine bedeutende unterschiedliche Expression aufweisen.
Mithilfe einseitiger FETs haben wir die Bedeutung der Proteinüberlappung zwischen dem Liquor-Proteom und einzelnen Gehirnmodulen beurteilt. Die Analyse ergab, dass insgesamt 14 Gehirnmodule im CSF-Datensatz statistisch signifikante Überlappungen aufweisen (FDR-bereinigter P <0,05) und ein zusätzliches Modul (M18), dessen Überlappung nahezu signifikant ist (FDR-bereinigter P = 0,06) (Abbildung 4C). , obere Reihe). Wir sind auch an Modulen interessiert, die stark mit differentiell exprimierten CSF-Proteinen überlappen. Daher führten wir zwei zusätzliche FET-Analysen durch, um zu bestimmen, (i) das CSF-Protein bei AD signifikant erhöht war und (ii) das CSF-Protein bei AD signifikant verringert war (P < 0,05, gepaarter t-Test AD/Kontrolle). Gehirnmodule mit sinnvoller Überlappung zwischen ihnen. Wie in der mittleren und unteren Reihe von Abbildung 4C dargestellt, zeigen diese zusätzlichen Analysen, dass 8 der 44 Gehirnmodule signifikant mit dem in AD CSF hinzugefügten Protein überlappen (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 und M38). . ), während nur zwei Module (M6 und M15) eine signifikante Überlappung mit dem reduzierten Protein in AD CSF zeigten. Wie erwartet befinden sich alle 10 Module in den 15 Modulen mit der höchsten Überlappung mit dem CSF-Proteom. Daher gehen wir davon aus, dass diese 15 Module ertragreiche Quellen für aus dem Gehirn stammende CSF-Biomarker von AD sind.
Wir haben diese 15 überlappenden Module basierend auf ihrer Nähe im WGCNA-Baumdiagramm und ihrer Assoziation mit Zelltypen und Genontologie zu fünf großen Proteinpanels gefaltet (Abbildung 4D). Das erste Panel enthält Module, die reich an Neuronenmarkern und synapsenbezogenen Proteinen (M1 und M12) sind. Das synaptische Panel enthält insgesamt 94 Proteine, und die Spiegel im Liquor-Proteom haben sich erheblich verändert, was es zur größten Quelle gehirnbezogener Liquor-Marker unter den fünf Panels macht. Die zweite Gruppe (M6 und M15) zeigte den engen Zusammenhang mit Endothelzellmarkern und Gefäßkörpern, wie „Wundheilung“ (M6) und „Regulierung der humoralen Immunantwort“ (M15). M15 steht auch in engem Zusammenhang mit dem Lipoproteinstoffwechsel, der eng mit dem Endothel zusammenhängt (36). Das Gefäßpanel enthält 34 Liquormarker, die sich auf das Gehirn beziehen. Die dritte Gruppe umfasst Module (M2 und M4), die einen signifikanten Zusammenhang mit Oligodendrozytenmarkern und Zellproliferation haben. Zu den Ontologiebegriffen der obersten Ebene von M2 gehören beispielsweise „positive Regulierung der DNA-Replikation“ und „Purin-Biosyntheseprozess“. Mittlerweile umfassen diejenigen von M4 „Gliazelldifferenzierung“ und „Chromosomensegregation“. Das Myelinisierungspanel enthält 49 CSF-Marker, die sich auf das Gehirn beziehen.
Die vierte Gruppe enthält die meisten Module (M30, M29, M18, M24 und M5), und fast alle Module sind signifikant reich an Mikroglia- und Astrozytenmarkern. Ähnlich wie das Myelinisierungspanel enthält auch das vierte Panel Module (M30, M29 und M18), die eng mit der Zellproliferation zusammenhängen. Die anderen Module dieser Gruppe haben einen starken Bezug zu immunologischen Begriffen wie „Immunwirkungsprozess“ (M5) und „Regulierung der Immunantwort“ (M24). Die gliale Immungruppe enthält 42 Liquormarker, die mit dem Gehirn in Zusammenhang stehen. Schließlich enthält das letzte Panel 52 gehirnbezogene Marker in den vier Modulen (M44, M3, M33 und M38), die alle mit dem Körper in Zusammenhang mit der Energiespeicherung und dem Stoffwechsel stehen. Das größte dieser Module (M3) steht in enger Beziehung zu den Mitochondrien und ist reich an neuronenspezifischen Markern. M38 ist eines der kleineren Modulmitglieder in diesem Metabolom und weist ebenfalls eine mäßige Neuronenspezifität auf.
Insgesamt spiegeln diese fünf Panels ein breites Spektrum an Zelltypen und -funktionen im AD-Kortex wider und enthalten zusammen 271 gehirnbezogene Liquormarker (Tabelle S2G). Um die Gültigkeit dieser MS-Ergebnisse zu bewerten, verwendeten wir den Proximity Extension Assay (PEA), eine auf orthogonalen Antikörpern basierende Technologie mit Multiplexing-Fähigkeiten, hoher Empfindlichkeit und Spezifität, und analysierten die Liquorproben erneut, bei denen wir eine Untergruppe dieser 271 Biomarker fanden (n = 36). Diese 36 Ziele zeigen die Veränderung des AD-Vielfachen von PEA, die eng mit unseren MS-basierten Ergebnissen zusammenhängt (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), was die Ergebnisse unserer umfassenden MS-Analyse stark bestätigte (Abbildung S4). ).
Die von unseren fünf Gruppen hervorgehobenen biologischen Themen, von der synaptischen Signalübertragung bis zum Energiestoffwechsel, stehen alle im Zusammenhang mit der Pathogenese von AD (1-3). Daher stehen alle 15 Module, die diese Panels enthalten, mit der von uns entdeckten AD-Pathologie im Gehirnproteom in Zusammenhang (Abbildung 2B). Am bemerkenswertesten ist die hohe positive pathologische Korrelation zwischen unseren Gliamodulen und die starke negative pathologische Korrelation zwischen unseren größten neuronalen Modulen (M1 und M3). Die differenzielle Expressionsanalyse unseres replizierten Gehirnproteoms (Abbildung S3D) zeigt auch von M5 und M18 abgeleitete Gliaproteine. Bei AsymAD und symptomatischer AD sind die Gliaproteine am stärksten erhöht und die M1-bezogenen Synapsen. Das Protein ist am stärksten reduziert. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die 271 Liquormarker, die wir in den fünf Gruppen identifiziert haben, mit Krankheitsprozessen im AD-Kortex zusammenhängen, einschließlich solcher, die in den frühen asymptomatischen Stadien auftreten.
Um die Änderungsrichtung der Panel-Proteine im Gehirn und in der Rückenmarksflüssigkeit besser analysieren zu können, haben wir für jedes der 15 überlappenden Module Folgendes gezeichnet: (i) haben wir das Modulhäufigkeitsniveau im Gehirndatensatz gefunden und (ii) das Modul Protein Der Unterschied wird in der Liquor cerebrospinalis ausgedrückt (Abbildung S5). Wie bereits erwähnt, wird WGCNA verwendet, um die Modulhäufigkeit oder den charakteristischen Proteinwert im Gehirn zu bestimmen (13). Die Vulkankarte wird verwendet, um die unterschiedliche Expression modularer Proteine in der Liquor cerebrospinalis (AD/Kontrolle) zu beschreiben. Diese Abbildungen zeigen, dass drei der fünf Panels unterschiedliche Expressionstrends im Gehirn und in der Rückenmarksflüssigkeit zeigen. Die beiden Module des Synapsenpanels (M1 und M12) zeigen eine Abnahme des Häufigkeitsniveaus im AD-Gehirn, überlappen sich jedoch deutlich mit dem erhöhten Protein im AD-CSF (Abbildung S5A). Die neuronenbezogenen Module, die das Metabolom enthalten (M3 und M38), zeigten ähnliche inkonsistente Expressionsmuster im Gehirn und in der Liquor (Abbildung S5E). Das Gefäßpanel zeigte ebenfalls unterschiedliche Expressionstrends, obwohl seine Module (M6 und M15) im AD-Gehirn moderat erhöht und im erkrankten Liquor erniedrigt waren (Abbildung S5B). Die verbleibenden zwei Panels enthalten große Glia-Netzwerke, deren Proteine in beiden Kompartimenten konsistent hochreguliert sind (Abbildung S5, C und D).
Bitte beachten Sie, dass diese Trends nicht für alle Marker in diesen Panels gelten. Beispielsweise umfasst das synaptische Panel mehrere Proteine, die im AD-Gehirn und im Liquor deutlich reduziert sind (Abbildung S5A). Zu diesen herunterregulierten Liquormarkern gehören NPTX2 und VGF von M1 sowie Chromogranin B von M12. Trotz dieser Ausnahmen sind die meisten unserer synaptischen Marker in der AD-Rückenmarksflüssigkeit erhöht. Insgesamt konnten diese Analysen in jedem unserer fünf Panels statistisch signifikante Trends im Gehirn- und Liquorspiegel erkennen. Diese Trends verdeutlichen die komplexe und oft unterschiedliche Beziehung zwischen Gehirn- und CSF-Proteinexpression bei AD.
Anschließend verwendeten wir eine Hochdurchsatz-MS-Replikationsanalyse (CSF-Replikation 1), um unseren 271-Biomarker-Satz auf die vielversprechendsten und reproduzierbarsten Ziele einzugrenzen (Abbildung 5A). CSF-Kopie 1 enthält insgesamt 96 Proben von Emory Goizueta ADRC, einschließlich Kontroll-, AsymAD- und AD-Kohorte (Tabelle S1A). Diese AD-Fälle sind durch einen leichten kognitiven Rückgang (mittlerer MoCA 20,0 ± 3,8) und Veränderungen der AD-Biomarker gekennzeichnet, die in der Liquor cerebrospinalis bestätigt wurden (Tabelle S1A). Im Gegensatz zur von uns gefundenen CSF-Analyse wird diese Replikation mithilfe einer effizienteren „Single-Shot“-MS-Methode mit hohem Durchsatz (ohne Offline-Fraktionierung) durchgeführt, einschließlich eines vereinfachten Probenvorbereitungsprotokolls, das die Notwendigkeit einer Immundepletion einzelner Proben überflüssig macht . Stattdessen wird ein einzelner immungeschwächter „Verstärkungskanal“ verwendet, um das Signal weniger häufig vorkommender Proteine zu verstärken (37). Obwohl es die gesamte Proteomabdeckung verringert, reduziert diese Single-Shot-Methode die Maschinenzeit erheblich und erhöht die Anzahl der TMT-markierten Proben, die lebensfähig analysiert werden können (17, 38). Insgesamt identifizierte die Analyse 6.487 Peptide, die in 96 Fällen 1.183 Proteomen zugeordnet wurden. Wie bei der CSF-Analyse haben wir festgestellt, dass nur die Proteine, die in mindestens 50 % der Proben quantifiziert wurden, in die nachfolgenden Berechnungen einbezogen wurden, und die Daten wurden für die Auswirkungen von Alter und Geschlecht regressiert. Dies führte zur endgültigen Quantifizierung von 792 Proteomen, von denen 95 % auch im gefundenen CSF-Datensatz identifiziert wurden.
(A) Gehirnbezogene CSF-Proteinziele, die in der ersten replizierten CSF-Kohorte verifiziert und in das endgültige Panel aufgenommen wurden (n = 60). (B bis E) Panel-Biomarkerspiegel (zusammengesetzte Z-Scores), gemessen in den vier CSF-Replikationskohorten. Gepaarte t-Tests oder ANOVA mit Tukey-Nachkorrektur wurden verwendet, um die statistische Signifikanz der Änderungen in der Häufigkeit in jeder Wiederholungsanalyse zu bewerten. CT, Kontrolle.
Da wir besonders daran interessiert sind, unsere 271 hirnbezogenen CSF-Ziele durch eine umfassende Analyse zu verifizieren, werden wir die weitere Untersuchung dieses replizierten Proteoms auf diese Marker beschränken. Von diesen 271 Proteinen wurden 100 in CSF-Replikation 1 nachgewiesen. Abbildung S6A zeigt die unterschiedliche Expression dieser 100 überlappenden Marker zwischen den Kontroll- und AD-Replikationsproben. Synaptische und metabolische Histone nehmen bei AD am stärksten zu, während vaskuläre Proteine bei Erkrankungen am stärksten abnehmen. Die meisten der 100 überlappenden Marker (n = 70) behielten in den beiden Datensätzen die gleiche Änderungsrichtung bei (Abbildung S6B). Diese 70 validierten hirnbezogenen CSF-Marker (Tabelle S2H) spiegeln weitgehend die zuvor beobachteten Panel-Expressionstrends wider, d. h. die Herunterregulierung vaskulärer Proteine und die Hochregulierung aller anderen Panels. Nur 10 dieser 70 validierten Proteine zeigten Veränderungen in der AD-Häufigkeit, die diesen Panel-Trends widersprachen. Um ein Panel zu erstellen, das den Gesamttrend des Gehirns und der Liquor cerebrospinalis am besten widerspiegelt, haben wir diese 10 Proteine aus dem Panel von Interesse ausgeschlossen, das wir schließlich überprüft haben (Abbildung 5A). Daher umfasst unser Panel letztendlich insgesamt 60 Proteine, die in zwei unabhängigen CSF-AD-Kohorten unter Verwendung unterschiedlicher Probenvorbereitung und MS-Plattformanalyse verifiziert wurden. Die Z-Score-Ausdrucksdiagramme dieser endgültigen Panels in den CSF-Kopie-1-Kontroll- und AD-Fällen bestätigten den Panel-Trend, der in der von uns gefundenen CSF-Kohorte beobachtet wurde (Abbildung 5B).
Unter diesen 60 Proteinen gibt es Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie mit AD assoziiert sind, wie etwa Osteopontin (SPP1), ein entzündungsförderndes Zytokin, das in vielen Studien mit AD in Verbindung gebracht wurde (39–41), und GAP43, ein synaptisches Protein das ist eindeutig mit Neurodegeneration verbunden (42). Die am vollständigsten verifizierten Proteine sind Marker im Zusammenhang mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. der mit der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) verbundenen Superoxiddismutase 1 (SOD1) und der mit der Parkinson-Krankheit verbundenen Desaccharase (PARK7). Wir haben auch bestätigt, dass viele andere Marker, wie SMOC1 und das Brain-Rich Membran Attachment Signaling Protein 1 (BASP1), bisher nur begrenzte Verbindungen zur Neurodegeneration aufweisen. Es ist erwähnenswert, dass es für uns aufgrund ihrer geringen Gesamthäufigkeit im CSF-Proteom schwierig ist, diese Einzelschuss-Nachweismethode mit hohem Durchsatz zum zuverlässigen Nachweis von MAPT und bestimmten anderen AD-bezogenen Proteinen (z. B. NEFL und NRGN) zu verwenden ) ( 43, 44).
Anschließend überprüften wir diese 60 prioritären Panel-Marker in drei weiteren Wiederholungsanalysen. In CSF-Kopie 2 verwendeten wir ein einziges TMT-MS, um eine unabhängige Kohorte von 297 Kontroll- und AD-Proben von Emory Goizueta ADRC (17) zu analysieren. CSF-Replikation 3 umfasste eine erneute Analyse der verfügbaren TMT-MS-Daten von 120 Kontroll- und AD-Patienten aus Lausanne, Schweiz (45). Wir haben mehr als zwei Drittel der 60 Prioritätsmarker in jedem Datensatz erkannt. Obwohl in der Schweizer Studie unterschiedliche MS-Plattformen und TMT-Quantifizierungsmethoden verwendet wurden (45, 46), haben wir unsere Panel-Trends in zwei wiederholten Analysen (Abbildung 5, C und D sowie Tabellen S2, I und J) genau reproduziert. Um die Krankheitsspezifität unserer Gruppe zu bewerten, analysierten wir mithilfe von TMT-MS den vierten Replikationsdatensatz (CSF-Replikation 4), der nicht nur Kontrollfälle (n = 18) und AD-Fälle (n = 17), sondern auch PD ( n = 14)), ALS- (n = 18) und frontotemporale Demenz (FTD)-Proben (n = 11) (Tabelle S1A). Wir haben fast zwei Drittel der Panel-Proteine in dieser Kohorte erfolgreich quantifiziert (38 von 60). Diese Ergebnisse verdeutlichen die AD-spezifischen Veränderungen in allen fünf Biomarker-Panels (Abbildung 5E und Tabelle S2K). Der Anstieg in der Metabolitengruppe zeigte die stärkste AD-Spezifität, gefolgt von der Myelinisierungs- und Gliagruppe. In geringerem Maße zeigt FTD auch einen Anstieg zwischen diesen Panels, was auf ähnliche potenzielle Netzwerkveränderungen zurückzuführen sein könnte (17). Im Gegensatz dazu zeigten ALS und PD fast die gleichen Myelinisierungs-, Glia- und Metabolomprofile wie die Kontrollgruppe. Insgesamt zeigen diese wiederholten Analysen trotz der Unterschiede in der Probenvorbereitung, der MS-Plattform und den TMT-Quantifizierungsmethoden, dass unsere Marker des Prioritätspanels in mehr als 500 einzigartigen CSF-Proben äußerst konsistente AD-spezifische Veränderungen aufweisen.
AD-Neurodegeneration wurde bereits mehrere Jahre vor dem Auftreten kognitiver Symptome weithin erkannt, daher besteht ein dringender Bedarf an Biomarkern für AsymAD (5, 31). Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass die Biologie von AsymAD alles andere als homogen ist und das komplexe Zusammenspiel von Risiko und Belastbarkeit zu großen individuellen Unterschieden im späteren Krankheitsverlauf führt (47). Obwohl sie zur Identifizierung von AsymAD-Fällen verwendet werden, haben sich die Werte der wichtigsten Liquor-Biomarker (Aβ1-42, Gesamt-Tau und p-Tau) nicht als zuverlässig vorhersagen lassen, wer an Demenz erkranken wird (4, 7), was auf mehr hindeutet Es ist notwendig, ganzheitliche Biomarker-Tools einzubeziehen, die auf mehreren Aspekten der Gehirnphysiologie basieren, um das Risiko dieser Population genau zu stratifizieren. Daher analysierten wir anschließend unser AD-validiertes Biomarker-Panel in der AsymAD-Population der CSF-Kopie 1. Diese 31 AsymAD-Fälle zeigten abnormale Kernbiomarkerwerte (Aβ1–42/Gesamt-Tau-ELISA-Verhältnis, <5,5) und vollständige Kognition (mittlerer MoCA, 27,1). ± 2,2) (Tabelle S1A). Darüber hinaus haben alle Personen mit AsymAD einen klinischen Demenz-Score von 0, was darauf hinweist, dass es keine Hinweise auf einen Rückgang der täglichen kognitiven oder funktionellen Leistungsfähigkeit gibt.
Wir analysierten zunächst die Werte der validierten Panels in allen 96 CSF-Replikaten 1, einschließlich der AsymAD-Kohorte. Wir fanden heraus, dass mehrere Panels in der AsymAD-Gruppe signifikante AD-ähnliche Häufigkeitsänderungen aufwiesen, das Gefäßpanel zeigte einen Abwärtstrend bei AsymAD, während alle anderen Panels einen Aufwärtstrend zeigten (Abbildung 6A). Daher zeigten alle Panels eine hochsignifikante Korrelation mit ELISA Aβ1-42 und den Gesamt-Tau-Werten (Abbildung 6B). Im Gegensatz dazu ist die Korrelation zwischen der Gruppe und dem MoCA-Score relativ schlecht. Eines der auffälligsten Ergebnisse dieser Analysen ist die große Bandbreite an Panel-Häufigkeiten in der AsymAD-Kohorte. Wie in Abbildung 6A dargestellt, kreuzt sich die Panelebene der AsymAD-Gruppe normalerweise mit der Panelebene der Kontrollgruppe und der AD-Gruppe, was eine relativ hohe Variabilität zeigt. Um diese Heterogenität von AsymAD weiter zu untersuchen, haben wir die Multidimensional Scaling (MDS)-Analyse auf 96 CSF-Replikations-1-Fälle angewendet. Die MDS-Analyse ermöglicht die Visualisierung der Ähnlichkeit zwischen Fällen basierend auf bestimmten Variablen im Datensatz. Für diese Clusteranalyse verwenden wir nur die validierten Panelmarker, die eine statistisch signifikante Änderung (P <0,05, AD/Kontrolle) auf der Ebene des CSF-Erkennungs- und Replikations-1-Proteoms (n = 29) (Tabelle S2L) aufweisen. Diese Analyse ergab eine klare räumliche Häufung zwischen unseren Kontroll- und AD-Fällen (Abbildung 6C). Im Gegensatz dazu sind einige AsymAD-Fälle eindeutig in der Kontrollgruppe gehäuft, während andere in den AD-Fällen angesiedelt sind. Um diese AsymAD-Heterogenität weiter zu untersuchen, haben wir unsere MDS-Karte verwendet, um zwei Gruppen dieser AsymAD-Fälle zu definieren. Die erste Gruppe umfasste AsymAD-Fälle, die näher an der Kontrolle lagen (n = 19), während die zweite Gruppe durch AsymAD-Fälle mit einem Markerprofil näher an AD gekennzeichnet war (n = 12).
(A) Das Expressionsniveau (Z-Score) der CSF-Biomarkergruppe in allen 96 Proben in der CSF-Replikations-1-Kohorte, einschließlich AsymAD. Die Varianzanalyse mit Tukeys Nachkorrektur wurde verwendet, um die statistische Signifikanz von Panel-Häufigkeitsänderungen zu bewerten. (B) Korrelationsanalyse der Panel-Proteinhäufigkeit (Z-Score) mit dem MoCA-Score und dem Gesamt-Tau-Level in ELISA Aβ1-42- und CSF-Kopie-1-Proben. Der Pearson-Korrelationskoeffizient mit dem relevanten P-Wert wird angezeigt. (C) Das MDS von 96 Fällen von CSF-Kopie 1 basierte auf den Häufigkeitsniveaus von 29 validierten Panelmarkern, die sowohl im Entdeckungs- als auch im CSF-Kopie-1-Datensatz signifikant verändert waren [P <0,05 AD/Kontrolle (CT)]. Diese Analyse wurde verwendet, um die AsymAD-Gruppe in Kontroll- (n = 19) und AD-Untergruppen (n = 12) zu unterteilen. (D) Das Vulkandiagramm zeigt die unterschiedliche Expression aller CSF-Replikations-1-Proteine mit log2-facher Änderung (x-Achse) relativ zum statistischen P-Wert von -log10 zwischen den beiden AsymAD-Untergruppen. Die Panel-Biomarker sind farbig. (E) CSF-Replikations-1-Häufigkeitsniveau der Selektionsgruppen-Biomarker wird zwischen AsymAD-Untergruppen unterschiedlich exprimiert. Zur Beurteilung der statistischen Signifikanz wurde Tukeys postadjustierte Varianzanalyse verwendet.
Wir untersuchten die unterschiedliche Proteinexpression zwischen diesen Kontroll- und AD-ähnlichen AsymAD-Fällen (Abbildung 6D und Tabelle S2L). Die resultierende Vulkankarte zeigt, dass sich 14 Tafelmarkierungen zwischen den beiden Gruppen erheblich verändert haben. Die meisten dieser Marker sind Mitglieder der Synapse und des Metaboloms. Zu dieser Gruppe gehören jedoch auch SOD1 und myristoyliertes Alanin-reiches Proteinkinase-C-Substrat (MARCKS), die Mitglieder der Myelin- bzw. Glia-Immungruppe sind (Abbildung 6, D und E). Das Gefäßpanel steuerte auch zwei Marker bei, die in der AD-ähnlichen AsymAD-Gruppe signifikant reduziert waren, darunter das AE-Bindungsprotein 1 (AEBP1) und das Mitglied der Komplementfamilie C9. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und der AD-ähnlichen AsymAD-Untergruppe im ELISA AB1-42 (P = 0,38) und p-Tau (P = 0,28), aber es gab tatsächlich einen signifikanten Unterschied im Gesamt-Tau-Spiegel (P = 0,0031). ) (Abb. S7). Es gibt mehrere Panel-Marker, die darauf hinweisen, dass die Veränderungen zwischen den beiden AsymAD-Untergruppen signifikanter sind als die gesamten Tau-Spiegel (z. B. YWHAZ, SOD1 und MDH1) (Abbildung 6E). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass unser validiertes Panel möglicherweise Biomarker enthält, die eine Subtypisierung und potenzielle Risikostratifizierung von Patienten mit asymptomatischer Erkrankung ermöglichen können.
Es besteht ein dringender Bedarf an systembasierten Biomarker-Tools, um die verschiedenen Pathophysiologien hinter AD besser messen und gezielt einsetzen zu können. Es wird erwartet, dass diese Tools nicht nur unser AD-Diagnosesystem verändern, sondern auch die Einführung wirksamer, patientenspezifischer Behandlungsstrategien fördern (1, 2). Zu diesem Zweck haben wir einen unvoreingenommenen umfassenden Proteomik-Ansatz auf AD-Gehirn und Liquor angewendet, um webbasierte Liquor-Biomarker zu identifizieren, die ein breites Spektrum gehirnbasierter Pathophysiologie widerspiegeln. Unsere Analyse ergab fünf CSF-Biomarker-Panels, die (i) Synapsen, Blutgefäße, Myelin, Immun- und Stoffwechselstörungen widerspiegeln; (ii) eine starke Reproduzierbarkeit auf verschiedenen MS-Plattformen zeigen; (iii) Sie zeigen fortschreitende krankheitsspezifische Veränderungen im frühen und späten Stadium der Alzheimer-Krankheit. Insgesamt stellen diese Ergebnisse einen vielversprechenden Schritt in Richtung der Entwicklung vielfältiger, zuverlässiger, weborientierter Biomarker-Tools für die Alzheimer-Forschung und klinische Anwendungen dar.
Unsere Ergebnisse belegen die hochkonservierte Organisation des AD-Hirnnetzwerk-Proteoms und unterstützen seine Verwendung als Anker für die systembasierte Biomarker-Entwicklung. Unsere Analyse zeigt, dass zwei unabhängige TMT-MS-Datensätze, die AD- und AsymAD-Gehirne enthalten, eine starke Modularität aufweisen. Diese Ergebnisse erweitern unsere bisherigen Arbeiten und belegen die Erhaltung der leistungsstarken Module von mehr als 2.000 Hirngeweben aus mehreren unabhängigen Kohorten im frontalen, parietalen und temporalen Kortex (17). Dieses Konsensnetzwerk spiegelt verschiedene krankheitsbedingte Veränderungen wider, die in der aktuellen Forschung beobachtet wurden, einschließlich der Zunahme gliareicher Entzündungsmodule und der Abnahme neuronenreicher Module. Wie die aktuelle Forschung weist auch dieses groß angelegte Netzwerk signifikante modulare Veränderungen in AsymAD auf, die eine Vielzahl unterschiedlicher präklinischer Pathophysiologien zeigen (17).
Innerhalb dieses äußerst konservativen systembasierten Rahmens gibt es jedoch eine feinkörnigere biologische Heterogenität, insbesondere bei Personen in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit. Unser Biomarker-Panel ist in der Lage, zwei Untergruppen in AsymAD darzustellen, die die signifikante unterschiedliche Expression mehrerer CSF-Marker zeigen. Unsere Gruppe konnte die biologischen Unterschiede zwischen diesen beiden Untergruppen hervorheben, die auf der Ebene der zentralen AD-Biomarker nicht offensichtlich waren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren die Aβ1-42/Gesamt-Tau-Verhältnisse dieser AsymAD-Personen ungewöhnlich niedrig. Allerdings unterschieden sich nur die Gesamt-Tau-Spiegel signifikant zwischen den beiden AsymAD-Untergruppen, während die Aβ1-42- und p-Tau-Spiegel relativ vergleichbar blieben. Da ein hoher Tau-Wert im Liquor ein besserer Prädiktor für kognitive Symptome zu sein scheint als der Aβ1-42-Spiegel (7), vermuten wir, dass die beiden AsymAD-Kohorten möglicherweise unterschiedliche Risiken für das Fortschreiten der Krankheit haben. Angesichts der begrenzten Stichprobengröße unseres AsymAD und des Mangels an Längsschnittdaten sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diese Schlussfolgerungen sicher zu ziehen. Diese Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass ein systembasiertes CSF-Panel unsere Fähigkeit zur effektiven Stratifizierung von Personen im asymptomatischen Stadium der Krankheit verbessern kann.
Insgesamt unterstützen unsere Ergebnisse die Rolle mehrerer biologischer Funktionen bei der Pathogenese von AD. Der gestörte Energiestoffwechsel wurde jedoch zum Hauptthema aller unserer fünf validierten Kennzeichnungsgremien. Stoffwechselproteine wie Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) und Laktatdehydrogenase A (LDHA) sind die am besten validierten synaptischen Biomarker, was darauf hindeutet, dass der Anstieg des AD-CSF auf hoch reproduzierbares Geschlecht zurückzuführen ist. Unsere Blutgefäße und Gliazellen enthalten außerdem mehrere Marker, die am Stoffwechsel oxidativer Substanzen beteiligt sind. Diese Erkenntnisse stehen im Einklang mit der Schlüsselrolle, die Stoffwechselprozesse im gesamten Gehirn spielen, nicht nur um den hohen Energiebedarf von Neuronen zu decken, sondern auch um den hohen Energiebedarf von Astrozyten und anderen Gliazellen zu decken (17, 48). Unsere Ergebnisse stützen zunehmende Hinweise darauf, dass Veränderungen im Redoxpotential und Unterbrechungen von Energiebahnen die zentrale Verbindung zwischen mehreren Schlüsselprozessen sein könnten, die an der Pathogenese von AD beteiligt sind, darunter mitochondriale Störungen, durch Glia vermittelte Entzündungen und Gefäßschäden (49). Darüber hinaus enthalten die metabolischen Biomarker der Liquor cerebrospinalis eine große Anzahl unterschiedlich reichhaltiger Proteine zwischen unseren Kontroll- und AD-ähnlichen AsymAD-Untergruppen, was darauf hindeutet, dass die Störung dieser Energie- und Redoxwege im präklinischen Stadium der Krankheit von entscheidender Bedeutung sein könnte.
Die unterschiedlichen Trends im Gehirn- und Liquor-Panel, die wir beobachtet haben, haben auch interessante biologische Auswirkungen. Synapsen und Metabolome, die reich an Neuronen sind, weisen im AD-Gehirn verringerte Werte und eine erhöhte Häufigkeit in der Liquor cerebrospinalis auf. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen an Synapsen reich an energieproduzierenden Mitochondrien sind, um Energie für ihre zahlreichen spezialisierten Signale bereitzustellen (50), ist eine Ähnlichkeit der Expressionsprofile dieser beiden Neuronengruppen zu erwarten. Der Verlust von Neuronen und die Extrusion geschädigter Zellen können diese Trends im Gehirn- und Liquor-Panel bei späteren Erkrankungen erklären, sie können jedoch nicht die frühen Panel-Veränderungen erklären, die wir beobachten (13). Eine mögliche Erklärung für diese Befunde bei frühen asymptomatischen Erkrankungen ist eine abnormale synaptische Beschneidung. Neue Erkenntnisse in Mausmodellen deuten darauf hin, dass die durch Mikroglia vermittelte synaptische Phagozytose bei AD abnormal aktiviert sein und zu einem frühen Synapsenverlust im Gehirn führen kann (51). Dieses verworfene synaptische Material kann sich im Liquor ansammeln, weshalb wir den Anstieg des Liquor im Neuronenpanel beobachten. Immunvermittelte synaptische Beschneidung könnte auch teilweise den Anstieg der Gliaproteine erklären, den wir während des Krankheitsprozesses im Gehirn und in der Liquor cerebrospinalis beobachten. Zusätzlich zur synaptischen Beschneidung können allgemeine Anomalien im Exozytoseweg auch zu einer unterschiedlichen Expression neuronaler Marker im Gehirn und im Liquor führen. Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass sich der Gehalt an Exosomen in der Pathogenese des AD-Gehirns verändert hat (52). Der extrazelluläre Weg ist auch an der Proliferation von Aβ beteiligt (53, 54). Es ist erwähnenswert, dass die Unterdrückung der exosomalen Sekretion die AD-ähnliche Pathologie in AD-transgenen Mausmodellen reduzieren kann (55).
Gleichzeitig zeigte das Protein im Gefäßpanel im AD-Gehirn einen moderaten Anstieg, im Liquor jedoch einen signifikanten Rückgang. Die Funktionsstörung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) kann diese Ergebnisse teilweise erklären. Viele unabhängige postmortale Studien am Menschen haben einen Abbau der Blut-Hirn-Schranke bei AD gezeigt (56, 57). Diese Studien bestätigten verschiedene abnormale Aktivitäten rund um diese dicht verschlossene Schicht aus Endothelzellen, darunter das Austreten von Gehirnkapillaren und die perivaskuläre Ansammlung von durch das Blut übertragenen Proteinen (57). Dies kann eine einfache Erklärung für die erhöhten Gefäßproteine im Gehirn liefern, kann jedoch nicht vollständig den Mangel an denselben Proteinen in der Liquor cerebrospinalis erklären. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das Zentralnervensystem diese Moleküle aktiv isoliert, um das Problem der erhöhten Entzündung und des oxidativen Stresses zu lösen. Die Verringerung einiger der schwerwiegendsten CSF-Proteine in diesem Panel, insbesondere derjenigen, die an der Lipoproteinregulierung beteiligt sind, hängt mit der Hemmung schädlicher Entzündungsniveaus und dem neuroprotektiven Prozess reaktiver Sauerstoffspezies zusammen. Dies gilt für Paroxonase 1 (PON1), ein Lipoprotein-bindendes Enzym, das für die Reduzierung des oxidativen Stressniveaus im Blutkreislauf verantwortlich ist (58, 59). Alpha-1-Mikroglobulin/Bikunin-Vorläufer (AMBP) ist ein weiterer deutlich herunterregulierter Marker der Gefäßgruppe. Es ist die Vorstufe des Lipidtransporters Bikunin, der auch an der Unterdrückung von Entzündungen und dem neurologischen Schutz beteiligt ist (60, 61).
Trotz verschiedener interessanter Hypothesen ist die Unfähigkeit, biochemische Krankheitsmechanismen direkt zu erkennen, eine bekannte Einschränkung der entdeckungsorientierten Proteomikanalyse. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um die Mechanismen hinter diesen Biomarker-Panels sicher zu definieren. Um die Entwicklung einer MS-basierten klinischen Analyse voranzutreiben, erfordert die zukünftige Ausrichtung auch den Einsatz gezielter quantitativer Methoden zur groß angelegten Biomarker-Verifizierung, wie etwa selektives oder paralleles Reaktionsmonitoring (62). Wir haben kürzlich die parallele Reaktionsüberwachung (63) verwendet, um viele der hier beschriebenen CSF-Proteinveränderungen zu validieren. Mehrere vorrangige Panel-Ziele werden mit erheblicher Genauigkeit quantifiziert, darunter YWHAZ, ALDOA und SMOC1, die jeweils unseren Synapsen-, Stoffwechsel- und Entzündungs-Panels zugeordnet sind (63). Unabhängige Datenerfassung (DIA) und andere MS-basierte Strategien können ebenfalls zur Zielüberprüfung nützlich sein. Bud et al. (64) Kürzlich wurde gezeigt, dass es eine erhebliche Überschneidung zwischen den in unserem CSF-Entdeckungsdatensatz identifizierten AD-Biomarkern und dem unabhängigen DIA-MS-Datensatz gibt, der aus fast 200 CSF-Proben aus drei verschiedenen europäischen Kohorten besteht. Diese aktuellen Studien belegen das Potenzial unserer Panels, sich in eine zuverlässige MS-basierte Erkennung umzuwandeln. Der traditionelle Antikörper- und Aptamer-basierte Nachweis ist auch für die Weiterentwicklung wichtiger AD-Biomarker wichtig. Aufgrund der geringen Häufigkeit von Liquor ist es schwieriger, diese Biomarker mit Hochdurchsatz-MS-Methoden nachzuweisen. NEFL und NRGN sind zwei Beispiele für CSF-Biomarker mit geringer Häufigkeit, die in unserer umfassenden Analyse dem Panel zugeordnet werden, mit unserer Single-MS-Strategie jedoch nicht zuverlässig erkannt werden können. Targeting-Strategien, die auf mehreren Antikörpern wie PEA basieren, können die klinische Transformation dieser Marker fördern.
Insgesamt bietet diese Studie einen einzigartigen Proteomics-Ansatz zur Identifizierung und Verifizierung von CSF-AD-Biomarkern auf der Grundlage verschiedener Systeme. Die Optimierung dieser Marker-Panels über zusätzliche AD-Kohorten und MS-Plattformen hinweg könnte sich als vielversprechend erweisen, um die Risikostratifizierung und Behandlung von AD voranzutreiben. Studien, die das Längsschnittniveau dieser Panels im Zeitverlauf bewerten, sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung, um zu bestimmen, welche Kombination von Markern das Risiko einer frühen Erkrankung und Veränderungen in der Schwere der Erkrankung am besten stratifiziert.
Mit Ausnahme der drei von CSF kopierten Proben wurden alle in dieser Studie verwendeten CSF-Proben unter der Schirmherrschaft von Emory ADRC oder eng verwandten Forschungseinrichtungen gesammelt. In diesen Proteomikstudien wurden insgesamt vier Sätze von Emory-CSF-Proben verwendet. Es wurde festgestellt, dass die CSF-Kohorte Proben von 20 gesunden Kontrollpersonen und 20 AD-Patienten enthielt. CSF-Kopie 1 umfasst Proben von 32 gesunden Kontrollpersonen, 31 AsymAD-Personen und 33 AD-Personen. CSF-Kopie 2 enthält 147 Kontrollen und 150 AD-Proben. Die CSF-Replikations-4-Kohorte mit mehreren Krankheiten umfasste 18 Kontroll-, 17 AD-, 19 ALS-, 13 PD- und 11 FTD-Proben. Gemäß der vom Emory University Institutional Review Board genehmigten Vereinbarung haben alle Teilnehmer der Emory-Studie eine Einverständniserklärung eingeholt. Gemäß den 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) wurde Liquor cerebrospinalis durch Lumbalpunktion gesammelt und gespeichert. Kontrollpatienten sowie AsymAD- und AD-Patienten erhielten eine standardisierte kognitive Beurteilung in der Emory Cognitive Neurology Clinic oder im Goizueta ADRC. Ihre Liquorproben wurden von INNO-BIA AlzBio3 Luminex auf ELISA Aβ1-42, Gesamt-Tau- und p-Tau-Analyse getestet (65). ELISA-Werte werden verwendet, um die diagnostische Klassifizierung von Probanden auf der Grundlage etablierter AD-Biomarker-Cut-Off-Kriterien zu unterstützen (66, 67). Grundlegende demografische und diagnostische Daten für andere CSF-Diagnosen (FTD, ALS und PD) werden auch von Emory ADRC oder angeschlossenen Forschungseinrichtungen bezogen. Die zusammenfassenden Fallmetadaten für diese Emory-CSF-Fälle finden Sie in Tabelle S1A. Die Merkmale der Schweizer CSF-Replikations-3-Kohorte wurden bereits veröffentlicht (45).
CSF hat die Probe gefunden. Um die Tiefe unserer Entdeckung des CSF-Datensatzes zu erhöhen, wurde vor der Trypsinisierung ein Immunkonsum von Proteinen mit hoher Häufigkeit durchgeführt. Kurz gesagt, 130 μl CSF aus 40 einzelnen CSF-Proben und ein gleiches Volumen (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) wurden bei Raumtemperatur in eine Spin-Säule (Thermo Fisher Scientific, A89868) gegeben Temperatur Inkubieren). Nach 15-minütigem Drehen die Probe 2 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Ein 3K-Ultrazentrifugalfiltergerät (Millipore, UFC500396) wurde verwendet, um die Abwasserprobe durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 14.000 g zu konzentrieren. Verdünnen Sie alle Probenvolumina mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 75 μl. Die Proteinkonzentration wurde mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode gemäß dem Protokoll des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) bewertet. Der immunabgereicherte CSF (60 μl) aus allen 40 Proben wurde mit Lysylendopeptidase (LysC) und Trypsin verdaut. Kurz gesagt, die Probe wurde mit 1,2 μl 0,5 M Tris-2(-carboxyethyl)phosphin und 3 μl 0,8 M Chloracetamid 10 Minuten lang bei 90 °C reduziert und alkyliert und anschließend 15 Minuten lang in einem Wasserbad beschallt. Die Probe wurde mit 193 μl 8 M Harnstoffpuffer [8 M Harnstoff und 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] auf eine Endkonzentration von 6 M Harnstoff verdünnt. LysC (4,5 μg; Wako) wird für den Übernachtverdau bei Raumtemperatur verwendet. Die Probe wurde dann mit 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) (68) auf 1 M Harnstoff verdünnt. Fügen Sie eine gleiche Menge (4,5 μg) Trypsin (Promega) hinzu und inkubieren Sie die Probe dann 12 Stunden lang. Ansäuern Sie die verdaute Peptidlösung auf eine Endkonzentration von 1 % Ameisensäure (FA) und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) (66) und entsalzen Sie sie dann mit einer 50 mg Sep-Pak C18-Säule (Waters) wie oben beschrieben (25). . Das Peptid wurde dann in 1 ml 50 % Acetonitril (ACN) eluiert. Um die Proteinquantifizierung über Chargen hinweg zu standardisieren (25), wurden 100-μl-Aliquots aus allen 40 CSF-Proben kombiniert, um eine gemischte Probe zu erzeugen, die dann in fünf globale interne Standardproben (GIS) (48) aufgeteilt wurde. Alle Einzelproben und kombinierten Standards werden im Hochgeschwindigkeitsvakuum (Labconco) getrocknet.
CSF kopiert die Probe. Dayon und Kollegen haben zuvor die Immunschwäche und den Verdau von CSF-Kopie-3-Proben beschrieben (45, 46). Die übrigen Replikatproben waren nicht einzeln immungeschwächt. Verdauen Sie diese nicht entfernten Proben in Trypsin, wie zuvor beschrieben (17). Für jede wiederholte Analyse wurden 120-μl-Aliquots des eluierten Peptids aus jeder Probe gepoolt und in Aliquots mit gleichem Volumen aufgeteilt, um als TMT-markierter globaler interner Standard verwendet zu werden (48). Alle Einzelproben und kombinierten Standards werden im Hochgeschwindigkeitsvakuum (Labconco) getrocknet. Um das Signal des CSF-Proteins mit geringer Häufigkeit zu verstärken, wurde durch Kombination von 125 μl aus jeder Probe eine „verstärkte“ Probe für jede Replikatanalyse vorbereitet [d. h. eine biologische Probe, die die Forschungsprobe nachahmt, die verfügbare Menge jedoch ist viel größer (37, 69)] verschmolzen zu einer gemischten Liquorprobe (17). Die gemischte Probe wurde dann mit 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) immunentfernt, wie oben beschrieben verdaut und in die anschließende mehrfache TMT-Markierung einbezogen.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 27. August 2021